Entwicklung einer optimierten kolorimetrischen RT

Apr 04, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21424 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Coronavirus-Pandemie hat den Bedarf an molekulardiagnostischen Tests verschärft. Eine zu diesem Zweck häufig verwendete Technik ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – eine empfindliche und spezifische Technik, die häufig als Goldstandard für die molekulare Diagnostik verwendet wird. Allerdings erfordert es hochqualifiziertes Personal und wartungsintensive Ausrüstung und ist relativ zeitaufwändig. Eine Alternative ist die LAMP-Technik (Loop-Mediated Isothermal Amplification), die keine Probenreinigung oder teure Ausrüstung erfordert und im Hinblick auf Empfindlichkeit und Spezifität der PCR ähnelt. In diesem Artikel haben wir einen optimierten kolorimetrischen RT-LAMP-Point-of-Care-Test (Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification) unter Verwendung eines tragbaren Geräts zur Diagnose von COVID-19 entwickelt. Variablen wie die Konzentration von Primern, Magnesiumsulfat, Betain, Hydrochlorid-Guanidin, Bst und die Temperatur der Reaktionen wurden getestet. Wir haben auch ein Pipettier-Qualitätskontrollsystem entwickelt – unter Verwendung einer Kombination von Farbstoffen –, um falsch negative Ergebnisse aufgrund eines Mangels an Proben, die dem Reaktionsteströhrchen hinzugefügt wurden, zu vermeiden. In die Zusammensetzung der RT-LAMP-Reaktionen wurde Mineralöl eingearbeitet, um eine Verdunstung zu vermeiden, wenn kein Heizdeckel verfügbar ist. Der endgültige RT-LAMP-Test ist im Vergleich zum WarmStart Colorimetric Master-Mix von New England Biolabs mit einer Empfindlichkeit von 5 Kopien pro μL zehnmal empfindlicher.

Im Dezember 2019 wurde die Welt Zeuge des Ausbruchs eines neuen Coronavirus namens Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 oder SARS-CoV-2. Der erste Fall der Infektion mit SARS-CoV-2 wurde in Wuhan, China, gemeldet und breitete sich bald über den ganzen Globus aus, so dass im März 20201 als neue Pandemie gemeldet wurde. Der Ausbruch der Pandemie machte den weltweiten Bedarf an Molekularbiologie deutlich Tests zur Identifizierung, Isolierung und Behandlung infizierter Personen als Mittel zur Eindämmung der Ausbreitung der Krankheit.

Die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)2 ist allgemein als Goldstandardtechnik für molekulare Tests von RNA-Viren wie SARS-CoV-2 bekannt. RT-PCR ist eine Technik mit hoher Sensitivität und Spezifität, erfordert jedoch kosten- und wartungsintensive Geräte, umfangreiche Probenreinigungsschritte und hochqualifiziertes Personal. Mit der raschen Zunahme infizierter Menschen wurde der Mangel an Reagenzien, Betriebsmitteln, Personal und Ausrüstung für molekulare Tests deutlich, und weltweit herrschte ein Mangel an Laborressourcen, um den Bedarf zu decken.

Die Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) wurde erstmals 2000 von Notomi und seinen Kollegen3 als eine Nukleinsäureamplifikationstechnik mit hoher Spezifität und Effizienz beschrieben, die unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden kann. Es verwendet eine Strangverdrängungs-DNA-Polymerase (ohne 5′ → 3′-Exonukleaseaktivität) und einen Satz von zwei bis drei Primerpaaren, die dazu dienen, Schleifen in der synthetisierten Einzelstrang-DNA zu erzeugen. Jedes Mal, wenn die Polymerase eine neue Amplifikation startet, gibt sie den zuvor gepaarten DNA-Strang frei, der eine Schleifenstruktur bildet, die neue Bindungsstellen für die Polymerase enthält, wodurch eine sich selbst fortpflanzende Amplifikation entsteht. Die Endprodukte der Reaktion sind blumenkohlartige Strukturen mit mehreren Schleifen, die durch Annealing zwischen abwechselnd invertierten Wiederholungen des Zielmoleküls gebildet werden3. Neben der PCR können LAMP-Reaktionen auch mit einem Reverse-Transkriptase-Enzym gekoppelt werden, um eine Amplifikation von RNA-Molekülen durchzuführen.

Der hohe Grad an DNA-Synthese, der bei LAMP-Reaktionen auftritt, ermöglicht den visuellen Nachweis einer positiven Reaktion. Immer wenn die DNA-Polymerase ein dNTP in den neu synthetisierten DNA-Strang einbaut, setzt sie als Nebenprodukt ein Pyrophosphat und ein Protonenmolekül frei. Das Pyrophosphat fällt in Gegenwart von Mg2+-Ionen als Magnesiumpyrophosphat aus und verändert die Trübung der Reaktion. Das freigesetzte Proton senkt den pH-Wert der Reaktion, was durch die Verwendung eines pH-empfindlichen kolorimetrischen Farbstoffs wie Phenolrot und Bromthymolblau4,5 nachgewiesen werden kann.

Isotherme kolorimetrische Nukleinsäureamplifikationstests (NAATs) haben bei der Reaktion auf die COVID-19-Pandemie eine zentrale Rolle gespielt. Abgesehen davon, dass hierfür kein Thermocycler erforderlich ist, wird auch die Probenverarbeitung vereinfacht6 und die Ergebnisse können mit bloßem Auge bestimmt werden. Diese Techniken wurden erfolgreich in Point-of-Care- und Behandlungsumgebungen (POCT) eingesetzt, wobei digitale Sensoren die Reaktionskontrolle und -analyse unterstützen. Über die einfache Einrichtung hinaus kann kolorimetrisches RT-LAMP auch in POCT-Diagnosetests mit RGB-Erkennung (Rot, Grün, Blau) verwendet werden, um die Genauigkeit zu erhöhen und gleichzeitig den Bedarf an teuren Filtern und Detektoren auszuschließen. Die Analyse von Zeitverlaufsdaten kann zu Verstärkungskurven führen, die denen von Fluoreszenzsystemen ähneln7.

Hier führen wir eine systematische Entwicklung eines kolorimetrischen RT-LAMP-Assays für SARS-CoV-2 durch, der für die Verwendung im Hilab® Molecular POCT-Gerät optimiert ist, einschließlich Feinabstimmung der Reagenzienkonzentration, Qualitätskontrollverfahren für den Bediener, Verdunstungsmanagement und Stabilität .

Die vollständige experimentelle Matrix bestand aus 192 verschiedenen Bedingungen (Tabelle S1). Für jeden Reaktionsparameter wurde ein Modell definiert, sowohl für positive als auch für negative Reaktionen, und Faktoren wurden basierend auf einem Pareto-Diagramm der standardisierten Effekte mit Alpha (α) = 0,05 beibehalten oder entfernt. Wir führten die Experimente mit einer einzigen Wiederholung durch und Ausreißer wurden basierend auf der Kurvenform und den erwarteten Ergebnissen manuell entfernt. Abbildung 1 veranschaulicht die Analyse der Versuchsergebnisse, einschließlich Rückstandsprofilen und Normalwahrscheinlichkeitsdiagrammen. Die Modellanpassung wurde aufgrund des Profils der Rückstandsverteilung als akzeptabel erachtet. Die ANOVA der Modelle ist in Abb. 2 zu finden, und Abb. 3 zeigt die Reaktionsoptimierung mit dem Ziel, die anfängliche Amplifikationszeit (Xt) und die Reaktionszeit (TTR) – die Zeit zum Erreichen von 50 % des Amplifikationsdeltas – zu minimieren – positiver Reaktionen und Minimierung des Nmax (Delta der Farbänderung zwischen der Anfangs- und der Endfarbe der Reaktion) negativer Reaktionen.

Analyse der mit der Software Minitab ermittelten Versuchsergebnisse mit dem Ziel, die Reaktionszeit (Time To Reaction, TTR) positiver Reaktionen zu minimieren. In (A) Restdiagramme. Das Normalwahrscheinlichkeitsdiagramm stellt dar, dass die analysierten Residuen normalverteilt sind. Das Histogramm stellt die Verteilung der Residuen dar. Das Diagramm „Residuen vs. Anpassungen“ zeigt, dass die Residuen zufällig verteilt sind, und das Diagramm „Residuen vs. Reihenfolge“ zeigt die Residuen in der Reihenfolge an, in der die Daten erfasst wurden. Dies zeigt, dass die Residuen unabhängig sind, da es in der Beobachtungsreihenfolge keine Muster gibt. (B) Normales Wahrscheinlichkeitsdiagramm mit α = 0,05, wobei die signifikanten Faktoren der Reihe nach waren: Primersequenz (F), Bst-Konzentration (B), Primerkonzentration (A), Magnesiumsulfatkonzentration (C) und die Kombination davon Primersequenz und Einstellung des pH-Werts (FG) von Hydrochlorid-Guanidin.

ANOVA der TTR-Antwort, erhalten aus der Software Minitab mit den getesteten Faktoren und dem jeweiligen P-Wert. Die Faktoren wie Primerkonzentration ([Primer]), Bst-Konzentration ([Bst]), Magnesiumsulfatkonzentration ([MgSO4]) und Primersequenz (Primer) waren statistisch signifikant, p < 0,05.

Antwortoptimierung aus Minitab durch Minimierung der anfänglichen Positivität (Ini_post) und TTR (TTR_post) positiver Reaktionen sowie Minimierung des Nmax (Farbdelta) negativer Reaktionen mit der Erwünschtheit von 0,989. Um die optimale Reaktion zu erzielen, enthielt das endgültige Modell Primer in einfacher Konzentration, Bst bei 0,4 U/μL (entspricht 50 %), Magnesiumsulfat bei 8 mM, Betain bei 400 mM, Primer, die auf die N- und Orf1ab-Sequenz abzielten, und eine Temperatur von 67 °C °C.

Die Modellierung der Ergebnisse der TTR-Reaktion positiver Reaktionen ergibt Primersequenz, Enzymkonzentration, Magnesiumsulfat und Primerkonzentration als signifikante Faktoren in dieser Reihenfolge. Die Modellierung zur manuellen Bestimmung des Amplifikationsstarts (Xt) und des Wendepunkts mithilfe der nichtlinearen Regression war im Wesentlichen dieselbe. Es wurde eine Optimierung zur Minimierung der modellierten Antwortvariablen durchgeführt und Fakultäts- und Erwünschtheitsdiagramme wurden verwendet, um die interessierenden Bereiche für die analysierten Faktoren zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die einfache Primerkonzentration (der getestete Maximalwert) optimal ist, wobei niedrigere Konzentrationen zu einem Anstieg der TTR-Werte führen. Höhere Temperaturen wirkten sich positiv auf die Reaktionszeiten aus. Der Typ der Primersequenz war für das NE-Paar schlechter und für die verbleibenden beiden Kombinationen ungefähr gleich, während die pH-Einstellung der Guanidinhydrochlorid (Gu-HCl)-Stammlösung kaum oder gar keine Auswirkungen auf die bewerteten Reaktionen zu haben scheint.

Das Modell für Nmax negativer Kontrollreaktionen wurde ebenfalls akzeptiert, mit R2 von 67,28 %. Faktordiagramme des Modells weisen auf eine Neigung zu unspezifischer Amplifikation bei erhöhten Konzentrationen von Polymerase und Magnesiumsulfat hin. Es wird ein umgekehrter Zusammenhang zwischen der Betainkonzentration beobachtet. Niedrigere Temperaturen erhöhen erwartungsgemäß die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Amplifikation.

Mit der Software Minitab können wir alle drei Modelle – TTR und anfängliche Amplifikationszeit (Xt) positiver Reaktionen minimieren und Nmax negativer Reaktionen minimieren – berücksichtigen, um für jede analysierte Variable die bessere Entscheidung zu treffen. Mit Minitab können wir die Bedeutung jeder analysierten Antwort aggregieren, um unter Berücksichtigung aller Antwortparameter eine bessere Anpassung zu erzielen. Hier erhalten die drei Antworten die gleiche Bedeutung (ein Gewicht von 1), wenn man jedoch berücksichtigt, dass in zwei der drei analysierten Antworten der Parameter Zeit (TTR und Anfangszeit) als \({\raise0.5ex\hbox{ $\scriptstyle 2$} \kern-0.1em/\kern-0.15em \lower0.25ex\hbox{$\scriptstyle 3$}}\) des Ergebnisses, um die Variablen auszuwählen. Unter Berücksichtigung aller drei Modelle schlägt die Software die optimalen Werte vor. Die besten Faktoren nach dieser Optimierungsrunde waren die einfache Primerkonzentration, das 0,5-fache von Bst (0,4 U/μL), 8 mM Magnesiumsulfat und 400 mM Betain bei einer Temperaturreaktion von 67 °C. Die gewählte Primerkombination war 1AN (Gen-N- und Orf1ab-Sequenz).

Unter Verwendung der oben genannten optimierten Bedingung konnten wir auch nach einer 60-minütigen Amplifikation keine falsch positiven Ergebnisse beobachten (Ergänzungsdatei).

Die pH-Bereiche der Farbverschiebung für jeden getesteten Indikatorfarbstoff sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Wir haben die pH-Indikatoren basierend auf der Komplexität der Herstellung von Stammlösungen, der Stabilität über Zeit und Temperaturen, der Farbstoffausfällung und dem pH-Bereich gegenüber der Farbverschiebung analysiert. Wir haben die Farbstoffe im Molecular HilabⓇ-Gerät in verschiedenen Reaktionsvolumina bewertet, da sie die Sättigung der Farbe beeinflussen können. Nach Angaben des Herstellers ist das Bst-Enzym bei pH-Werten von 5 bis 10 stabil, Farbstoffe, die außerhalb dieses Bereichs oder zu nahe an den unteren und oberen Enden lagen, wurden als potenzielle Indikatoren nicht berücksichtigt. Abbildung S1 zeigt den Farbverlauf für jeden getesteten pH-Indikatorfarbstoff.

Metacresolpurpur löste sich in hochreinem Typ-1-Nuklease-freiem Wasser oder TE-Puffer nicht vollständig auf und wurde daher aus den nachfolgenden Tests verworfen. Da das Molecular HilabⓇ-Gerät das Reaktionsergebnis als Farbzeitreihe anzeigt, könnte die Verwendung von pH-Indikatorfarbstoffen, die als farblose Lösung beginnen, als Nichteinsetzen der Reaktionsröhrchen interpretiert werden. Aus diesem Grund wurden o-Cresolphtalein und α-Naphtholphthalein als potenzielle Indikatoren verworfen.

Bromthymolblau und Bromkresolpurpur zeigten eine gute Farbänderung (von Tiefblau bzw. Lila zu Gelb) und Stabilität. Kresolrot und Chlorphenolrot erzielten ähnliche Ergebnisse wie Phenolrot, das bereits im LAMP-Master-Mix von NEB verwendet wird. Nach dem Screening wurde Bromthymolblau als stabilster pH-Indikator ausgewählt, der eine große Farbverschiebung von Blau nach Gelb aufwies, was einem Unterschied von 180° in der Farbtonskala entspricht. Die optimale Konzentration des Bromthymolblaus in der RT-LAMP-Reaktion wurde getestet und bei 100 μM definiert – da Konzentrationen darunter zu einer hellblauen Farbe führten und darüber die Reaktions-TTR erhöhten (Daten nicht gezeigt).

Wir haben die Zugabe von 1–4 µL 10 mM KOH (Kaliumhydroxid) getestet, um den Einfluss des Start-pH-Werts der Reaktion zu bewerten. Die analysierten Parameter waren TTR und Nmax. Interessanterweise wurde bei beiden Parametern kein signifikanter Unterschied beobachtet. Der Zustand mit der niedrigsten TTR und dem höheren Nmax wurde jedoch mit 1,2 mM KOH in der Endreaktion erreicht. Der Nmax betrug ungefähr 54 (± 4) mit einer TTR von 420 s, wenn eine Positivkontrolle verwendet wurde (1 × 106 Genomäquivalente/Reaktion) (Abb. S2).

Als Point-of-Care-Test bestand unser Ziel darin, ein Kit zu entwickeln, das die Manipulation für den Bediener minimiert und vereinfacht. Um das Verfahren zu vereinfachen, haben wir einige Farbstoffkombinationen in der Probenlösung getestet. Auf diese Weise könnte der Bediener sehen, ob die Probe in das Reaktionsgefäß gegeben wurde und ob das pipettierte Volumen korrekt war, wodurch falsch-negative Ergebnisse aufgrund einer fehlenden Probenzugabe vermieden werden. Da frühere Arbeiten gezeigt hatten, dass eine Kombination von pH-Indikatorfarbstoffen in LAMP-Reaktionen8 verwendet werden kann, haben wir in unseren Reaktionen die Kombination von Bromthymolblau mit Phenolrot oder Kresolrot getestet.

Die Kombination von Bromthymolblau und Kresolrot führte nach Probenzugabe zu einer trüben bläulichen Farbe (Abb. 4 – Röhrchen 25–32). Nach einer 30-minütigen Amplifikation konnte die Farbe in den Positivkontrollröhrchen (33–35 und 37–39) leicht von der Farbe der Nicht-Template-Kontrollen (NTC) (Röhrchen 36 und 40) unterschieden werden. Phenolrot wurde als bester Farbstoff für die Zusammensetzung der Probenlösung ausgewählt. Nach Zugabe der Probe änderte sich die Farbe der Reaktion von Blau (Röhrchen 1–8) nach Lila (Röhrchen 9–16), was für den Bediener eine wahrnehmbare Farbänderung darstellte. Bei der Amplifikation war die Endfarbe ein leuchtendes Gelb (Röhren 17–19; 21–23) und unterschied sich deutlich von den NTC-Röhren (20 und 24) (Abb. 4). Außerdem konnten wir mit der Kombination der Farbstoffe einen zufriedenstellenden Nmax- und TTR-Wert (< 600 s) erzielen.

Reaktionen mit verschiedenen Farbstoffen vor und nach 30-minütiger Inkubation bei 67 °C. Die Röhrchen 1–8 enthielten nur Bromthymolblau und zeigten die Farbe der Reaktion vor Zugabe der Probe. Die Probelösungen enthielten entweder Phenolrot oder Kresolrot. Die Röhrchen 9–16 stellen die Röhrchen 1–8 nach der Probenzugabe mit einer Phenolrot enthaltenden Lösung dar, und die Röhrchen 17–24 sind nach 30-minütiger Inkubation bei 67 °C dargestellt. Die Röhrchen 25–32 stellen die Röhrchen 1–8 nach der Probenzugabe mit einer Kresolrot enthaltenden Lösung dar, und nach einer 30-minütigen Inkubation bei 67 °C ergaben sich die Ergebnisse der Röhrchen 33–40. Die Röhrchen 12, 16, 28 und 32 waren Kontrollen ohne Vorlage. Die Endkonzentration der Farbstoffe in den Röhrchen betrug: Röhrchen 1–4 enthielten 50 μM Bromthymolblau; 5–8 enthielten 100 μM Bromthymolblau; 9–12 und 17–20 enthielten 50 μM Bromthymolblau und 100 μM Phenolrot; 13–16 und 21–24 enthielten 100 μM Bromthymolblau und 100 μM Phenolrot; 25–28 und 33–36 enthielten 100 μM Bromthymolblau und 100 μM Kresolrot; 29–32 und 37–40 enthielten 50 μM Bromthymolblau und 100 μM Kresolrot.

Bei einer 30-minütigen Amplifikation konnten wir keine falsch-positive Reaktion beobachten.

Da die in dieser Arbeit verwendete kolorimetrische LAMP-Reaktion pH-abhängig ist, sollten wir analysieren, ob der pH-Wert der Probenlösung die Reaktionsparameter wie Nmax und TTR beeinträchtigen könnte. Probenlösungen wurden bei fünf verschiedenen pH-Werten im Bereich von 7 bis 9 getestet, mit einem Anstieg um 0,5. Ohne jegliche Anpassung hatte die Lösung einen pH-Wert von etwa 8,5, sodass wir entweder NaOH oder HCl hinzufügen mussten, um den gewünschten pH-Wert zu erreichen. Nachdem wir eine Nasopharynx-Abstrichprobe in die Lösung geschwenkt hatten, stellten wir fest, dass sich die rosa Farbe verstärkte, was auf eine gewisse Basifizierung hindeutete.

Beim Testen mit internen Kontrollprimern für menschliches rActin fielen alle Reaktionen positiv aus (Tabelle S2). Ein höherer pH-Wert der Probenlösung verursachte jedoch erwartungsgemäß einen Anstieg der TTR (Tabelle S3). Probenlösungen mit einem pH-Wert von 7,0–7,5 zeigten eine höhere Konsistenz zwischen den Replikaten und niedrigere TTR-Werte (642 ± 54 bzw. 714 ± 24 s).

Kolorimetrische Reaktionen, die auf einer pH-Änderung beruhen, sind nicht mit Pufferlösungen kompatibel und enthalten normalerweise nur Verschleppungen aus Enzymspeicherpuffern. Wir haben jedoch festgestellt, dass bei der Verwendung hochkonzentrierter Enzyme (Stammlösungen mit 120 U/μL) und damit einer geringeren Pufferübertragung die Reaktionen, die Bromthymolblau enthielten, schnell ansäuerten. Etwa 15 Minuten im Eis reichten aus, um eine sichtbare Änderung der Reaktionsfarbe von blau nach grünlich zu bewirken. Wir haben getestet, ob es eine optimale Tris-Konzentration gibt, die Farbveränderungen während der Vorbereitung der Röhrchen verhindert, ohne den Amplifikationsschritt zu beeinträchtigen. Wir analysierten den Delta-Wert (Nmax) und den Anfangszeitpunkt der Amplifikation (Xt), die in jeder Bedingung direkt nach der Herstellung des Reaktionsgemisches erhalten wurden.

Es konnte beobachtet werden, dass mit zunehmender Tris-Konzentration auch die anfängliche Amplifikationszeit zunahm (Abb. S3). Aufgrund der Puffereigenschaften von Tris im pH-Bereich von 6 bis 8 war es schwieriger, den pH-Wert der Reaktionen und damit auch deren Farbe zu ändern, je höher die Tris-Konzentration war. Die Tris-Konzentration und die Nmax waren umgekehrt proportional; eine höhere Tris-Menge führte zu einem niedrigeren Delta (Nmax) der Reaktionsfarbe im Vergleich zur niedrigsten getesteten Tris-Konzentration (510 μM).

Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den verschiedenen Methoden der Probenzugabe, d. h. die Anwesenheit des Mineralöls war bei der Zugabe der Probe zur Reaktion kein Problem. Darüber hinaus kam es unter den Bedingungen, bei denen der Reaktion 0 oder 5 μl Mineralöl zugesetzt wurden, immer noch zur Verdunstung, da kleine Tröpfchen in der Mikroröhrchenkappe beobachtet werden konnten und das Volumen am Boden des Mikroröhrchens abnahm (Abb. 5). Wir haben festgestellt, dass es ohne das Mineralöl nicht möglich war, eine Stabilisierung des Nmax zu erreichen, da die Verdunstung während der Verstärkung erfolgte, wodurch die Sättigung der eingefangenen Farbe zunahm, was zu einem höheren Nmax führte.

Wirkung des Mineralöls nach 60-minütiger Amplifikation bei 67 °C. In den Röhrchen 1, 2 und 7 erfolgte keine Zugabe des Mineralöls; Die Röhrchen 3 und 4 erhielten 5 μl Mineralöl und die Röhrchen 5, 6 und 8 erhielten 10 μl Mineralöl. Die Röhrchen 1–6 erhielten eine SARS-CoV-2-Positivkontrolle und die Röhrchen 7 und 8 waren Negativkontrollen.

Das endgültige Protokoll sah die Zugabe von 12 μl Mineralöl zu einer 20 μl-Reaktion vor, da im Mikroröhrchendeckel keine Tröpfchen beobachtet wurden – das Volumen am Boden des Röhrchens blieb während des gesamten Tests gleich – und dies war möglich um eine Stabilisierung des Nmax-Wertes zu erreichen. Wir haben keinen signifikanten Unterschied in der TTR oder Empfindlichkeit beobachtet, wenn der Reaktion Mineralöl zugesetzt wurde.

Der Grenzwert wurde auf 5 Genomäquivalente pro μL mit 100 % Positivität (10/10) mit einem Nmax-Mittelwert von 54 (± 26) und einer anfänglichen Amplifikationszeit (Xt) von etwa 1302 s (± 396) festgelegt (Abb. 6 und Abb. S4). Weitere Experimente zur Simulation von Transport und Lagerung werden durchgeführt, um zu analysieren, ob die Testempfindlichkeit gleich bleibt.

Nachweisgrenze des Tests unter Verwendung einer Kontrolllösung, die die Plasmide pUC57 enthält, die mit den synthetischen DNA-Sequenzen geklont sind, die entweder den Stellen des Gens N oder Orf1ab entsprechen. (A) Auf der x-Achse ist die Verdünnung der Kontrolllösung in Kopien pro Reaktion in Log und auf der y-Achse ist die Xt (Anfangszeit der Amplifikation in Sekunden) der Reaktionen angegeben. (B) Auf der x-Achse ist die Verdünnung der Kontrolllösung in Kopien pro Reaktion und auf der y-Achse ist die Nmax der Reaktion angegeben.

In Tabelle 2 fassen wir die optimierte Zusammensetzung des Reaktionspuffers und der Probenlösung zusammen. Nasopharyngeale Abstrichproben können 10 Minuten lang bei 95 °C hitzeinaktiviert oder ohne Behandlung der Reaktion hinzugefügt werden. Nach der Probenzugabe sollte die Amplifikation 30 Minuten lang bei 67 °C durchgeführt werden.

Kolorimetrische RT-LAMP-Reaktionen haben die molekularen POCT-Tests revolutioniert und ermöglichen kostengünstige Geräte mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität – charakteristisch für molekulare Tests wie qPCR9. Obwohl kolorimetrische Reaktionen aufgrund der einfachen Unterscheidung zwischen negativen und positiven Reaktionen durch Beobachtung mit bloßem Auge häufig verwendet werden, ermöglichen sie auch den Ersatz teurer und instabiler Fluorophore und Filteraufbauten durch einfachere Datenerfassungssysteme. In unserer Studie haben wir das Hilab® Molecular-Gerät verwendet, das über eine RGB-Erkennung in Verbindung mit weißen LEDs und Internetverbindung über WLAN oder USB verfügt und eine gleichzeitige Überwachung der Reaktion und eine Fernauswertung des Tests durch medizinisches Fachpersonal ermöglicht. In der vorliegenden Studie haben wir mithilfe des Hilab® Molecular-Geräts eine neuartige Formulierung entwickelt, die für die Fernanalyse von POCT-Tests optimiert ist.

Die Quantifizierung von amplifiziertem genetischem Material durch qPCR-Reaktionen kann anhand von Temperaturzyklen gemessen werden, bei denen die Menge an DNA in jedem Zyklus verdoppelt wird, was es einfacher macht, den Reaktionsfortschritt zu interpretieren und die anfängliche Probenlast abzuschätzen. Andererseits laufen RT-LAMP-Reaktionen bei einer einzigen Temperatur ab und weisen im Vergleich zur qPCR eine komplexe Kinetik auf. Kolorimetrische LAMP-Reaktionen können jedoch als Parameter wie Reaktionszeit (TTR), Anfangszeit der Amplifikation (Xt) und maximale Farbänderung (Nmax) beschrieben werden. Dennoch haben wir gezeigt, dass diese Parameter immer noch hilfreich für die empirische Modellierung einer quantitativen Messung der Amplifikationsrate mithilfe von DoE sind. Akzeptable Bedingungen wurden für fünf kontinuierliche und zwei kategoriale Variablen mit etwa 200 nicht replizierten Testbedingungen erhalten. Selbst nach der Entfernung von Ausreißern waren die erhaltenen Modelle akzeptabel und wurden erfolgreich verwendet, um optimierte Bedingungen für unsere spezifischen Testbedingungen zu erhalten.

Unter allen getesteten Parametern beobachteten wir, dass die Primersequenz – die auf das N-, ORF1ab- oder E-Gen abzielte –, die Bst-, Primer- und Magnesiumsulfatkonzentrationen am signifikantesten waren (α = 0,05). Dies steht im Einklang mit anderen Arbeiten, in denen die Optimierung von Komponenten getestet wurde und die ebenfalls zeigten, dass eine Erhöhung der Enzym- und MgSO4-Konzentration10,11 die Leistung der Reaktion verbesserte. In unserem Fall war die beste Konzentration 0,4 U/μL Bst und 8 mM MgSO4. Der WarmStart-Mastermix der NEB für SARS-CoV-2 (der die Bst-DNA-Polymerase 2.0 enthält) empfiehlt einen Tris-Bereich von 0,5 bis 5 mM12. Wir haben festgestellt, dass die niedrigste erreichbare Tris-Konzentration (510 μM) eine niedrigere Konzentration ergibt TTR. Dies steht im Einklang mit den Puffereigenschaften von Tris, da die Reaktion schwach gepuffert werden muss, um die Farbänderung des pH-abhängigen Farbstoffs zu ermöglichen. Sie empfehlen außerdem, dass der pH-Wert der Mastermischung zwischen 7,5 und 9,0 liegen sollte. Wir haben die KOH-Konzentration getestet, um einen anfänglichen pH-Wert der Reaktion zu definieren, der eine niedrigere TTR und einen höheren Nmax ergibt. Wir haben gesehen, dass die getesteten KOH-Konzentrationen keinen statistisch signifikanten Unterschied in der TTR oder Nmax aufwiesen, obwohl eine Endkonzentration von 1,2 mM eine etwas bessere Farbverschiebung (Nmax) ergab. Wir befassten uns auch mit der pH-Einstellung der Probenlösung, indem wir die TTR und Nmax der Reaktion direkt nach ihrer Herstellung und durch die Abnahme ihres pH-Werts im Laufe der Zeit maßen. Eine Probenlösung mit einem pH-Wert zwischen 7 und 7,5 zeigt eine niedrigere TTR der Reaktion und weist eine bessere Stabilisierung des pH-Werts während der Lagerung auf. Darüber hinaus zeigte ein höherer pH-Wert eine signifikante pH-Reduktion über mehrere Wochen Lagerung (Daten nicht gezeigt).

Guanidinhydrochlorid mit einem pH-Wert von 8,0 verbessert nachweislich die LAMP-Reaktion13. Wir beobachteten, dass die Anpassung des Gu-HCl-pH-Werts auf 8,0 keinen wesentlichen Einfluss auf die TTR oder Nmax der Reaktion hatte. Darüber hinaus nahm der pH-Wert von Gu-HCl mit der Zeit ab, was mit einer Langzeitlagerung nicht vereinbar ist, und eine Anpassung kurz vor der Verwendung ist mit einem POC-Test nicht vereinbar. Ein weiterer getesteter Zusatzstoff war Betain, das in PCR- und LAMP-Techniken verwendet wurde, um die Spezifität des Assays zu verbessern14,15. Bei einer Konzentration von 400 mM Betain konnten wir keine unspezifische Amplifikation feststellen, anders als in einer anderen Studie15.

Eine Kombination von Farbstoffen in der Reaktionsmischung wurde zuvor getestet, um die Anwendung von kolorimetrischem LAMP8 zu erweitern. Hier verwenden wir jedoch die Kombination verschiedener Farbstoffe zur Kontrolle des Pipettierens, um sicherzustellen, dass der Bediener die Probe in das Reaktionsgefäß gegeben hat, und so falsche Ergebnisse zu vermeiden Negative durch fehlende Probenzugabe. Die Probenlösung enthält Phenolrot und nach Zugabe der Probe zum Reaktionsgemisch, das Bromthymolblau enthält, wird die Farbe violett. Insbesondere bei der molekularen Diagnostik ist die Qualitätskontrolle ferngesteuerter Tests von größter Bedeutung. Die Einbeziehung des Farbstoffs in den Probenpuffer scheint die Effizienz der Probenbehandlung nicht zu beeinträchtigen und hat wahrscheinlich auch keinen Einfluss auf die Hitzeinaktivierung. Unter den acht getesteten Farbstoffen wählten wir den Bromthymolblau-Farbstoff für die Zusammensetzung der Reaktionsmischung und den Phenolrot-Farbstoff für die Probenlösung. Das Gegenteil (Phenolrot im Reaktionsgemisch und Bromthymolblau in der Probenlösung) wurde nicht genehmigt, da die Probenlösung dunkler und als diagnostisches Produkt unattraktiv werden würde. Beide Farbstoffe waren stabil, mit einem pH-Bereich, der mit unserer Reaktion kompatibel war, und die Farbänderung wurde im RGB-System besser erkannt. Darüber hinaus wurden diese beiden Farbstoffe häufig in kolorimetrischen LAMP-Reaktionen verwendet4,8,16,17.

Das Hilab® Molecular-Gerät verfügt nicht über einen beheizten Deckel, um die Produktion zu erleichtern und die Robustheit durch die Reduzierung der Anzahl beweglicher Teile zu erhöhen. Dies macht Reaktionen jedoch anfällig für übermäßige Verdunstung, was zu einer möglichen Fehlinterpretation kolorimetrischer Reaktionen aufgrund der Erhöhung der Farbsättigung führen kann. Um dieses Problem zu mildern, wurde Mineralöl für die PCR getestet, um eine Verdunstung zu verhindern18. Wir haben herausgefunden, dass die Zugabe des Öls die Verdunstung vollständig hemmen und die Farbe stabilisieren kann, ohne dass dies negative Auswirkungen auf das Signal oder die Reaktionszeit hat. Das Vorhandensein von Mineralöl hatte keinen Einfluss auf den Prozess der Probenübertragung, unabhängig davon, ob es über oder unter der Mineralölschicht hinzugefügt wurde. Auch das Homogenisieren der Lösung mit einer Pipette oder Klopfen auf die Seiten des Röhrchens hatte keinen Einfluss auf die Reaktionseffizienz. Die Ölschicht war nach wenigen Sekunden wieder aufgebaut. Das Mineralöl kann vorher zugegeben und die Reaktion mit dem Öl eingefroren werden. Darüber hinaus ermöglicht das Öl die Durchführung der Reaktion in einfacheren Umgebungen, z. B. in einem Trockenblock.

Die erreichte Nachweisgrenze (LoD) betrug 5 Kopien pro μL mit 100 % Positivität unter Verwendung der synthetischen Kontrolle – ähnlich wie bei anderen RT-LAMP-Assays19. Frühere Experimente, die in unserem Labor mit dem WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix der NEB mit Primern durchgeführt wurden, die auf die Gene N und E von SARS-CoV-2 abzielen, konnten keine Nachweisgrenze unter 50 Kopien pro μL erreichen (Daten nicht gezeigt). Die Nachweisgrenze von RT-PCR-Tests mit gereinigten Proben variiert zwischen 0,0819 und 1420 Kopien pro μL21,22,23. Beim Vergleich unserer LoD mit anderen molekularen Tests, die einen direkten Abstrich verwenden, lag unsere Nachweisgrenze bei 25.000 Kopien pro ml, während die LoD der kommerziellen Tests 60.000–540.000 NDU pro ml betrug24 – virale RNA-Kopien/ml entspricht den Genomkopieäquivalenten/ml ( GCE/ml) oder nachweisbare Nukleinsäureeinheiten/ml (NDU/ml)25. Die erhaltenen Ergebnisse wurden nicht mit dem RT-qPCR-Assay verglichen, da unsere Technik ungereinigte Proben verwendet.

Es müssen noch Stabilitätstests durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob die LoD nach einer langen Lagerungszeit gleich bleibt. Eine klinische Validierung des Tests anhand von Patientenproben, die positiv auf COVID-19 sind, ist ebenfalls erforderlich.

Es ist wichtig zu beachten, dass die hier gefundenen Ergebnisse mit 4 μL Probenlösung und einem Endreaktionsvolumen von 20 μL erzielt wurden. Die Ergebnisse können abweichen, wenn sich der Anteil der zugegebenen Probe oder die Zusammensetzung der Probenlösung ändert. Darüber hinaus kann eine Erhöhung des Gesamtvolumens der Reaktion zwar die Empfindlichkeit verbessern26, dies kann jedoch auch die Kosten des Tests erhöhen.

Hier haben wir die Reaktionsbedingungen für den kolorimetrischen Nachweis von Nukleinsäuren in POCT-Umgebungen erfolgreich optimiert, mit einer zehnfach höheren Empfindlichkeit im Vergleich zum WarmStart Colorimetric LAMP Master Mix von NEB. Unser Master-Mix-Rezept kann Farbsignalunterschiede maximieren, die Amplifikationszeit von Zielsequenzen minimieren, die Probenzugabe steuern und kann in einer gekühlten Umgebung verwendet werden. Dank der Zugabe von Mineralöl sind auch längere Reaktionszeiten möglich, ohne dass das Volumen verdunstet, auch ohne Verwendung eines beheizten Deckels. Die unspezifische Verstärkung wurde auch durch die Optimierung der Response Surface Methodology (RSM) gemindert. Diese Verbesserungen ermöglichen kostengünstigere Screening-Tests in einer Vielzahl möglicher Konfigurationen.

Bst 2.0 WarmStart® DNA Polymerase (M0538), Antarctic Thermolabile UDG (M0372), WarmStart® RTx Reverse Transcriptase (M0380) sowie dNTPs (N0446S und N0459S) wurden von New England Biolabs (NEB) erworben. Phenolrot (114529), Mineralöl (M5904), Kaliumchlorid (P9541), Kaliumhydroxid (P5958), Magnesiumsulfat (M3409), Tween-20 (P9416), Guanidinhydrochlorid (G3272), Tris-Hydrochlorid (93363) und Betain (B0300) wurde von Sigma-Aldrich erworben. Reinstwasser Typ I (10977) und TE-Puffer pH 8,0 (93283) wurden von Invitrogen erworben. Die Farbstoffe Bromthymolblau (AB08416RA), Kresolrot (VC09256RA), Chlorphenolrot (VC06226RA), Bromkresolpurpur (PB06593RA), Metakresolpurpur (PM06383RA), α-Naphtholphthalein (AN07911RA) und O-Kresolphthalein (C05368RA) wurden von Êxodo Científica erworben .

Die verwendeten Primersequenzen zielten auf das N-Gen, die E-Gene13 oder die Orf1ab-Sequenz27 von SARS-CoV-2 ab. Als interne Kontrolle wurde ein Satz Primer verwendet, die auf die humane ACTB-mRNA-Sequenz abzielen (Tabelle S2). Die Primer wurden bei Exxtend mit HPLC-Reinigung bestellt und in hochreinem, nukleasefreiem Typ-1-Wasser auf 200 μM resuspendiert. Um das Pipettieren zu erleichtern, wurden die Primer als zehnfach konzentrierte Primermischung zubereitet. Die interne Kontroll-Primermischung bestand nur aus ACTB-Primern, während die SARS-CoV-2-Primermischung aus einer Kombination von zwei Primersätzen bestand, die entweder auf N- und E-Gene, N- und Orf1ab-Gene oder E- und Orf1ab-Gene abzielten. Jede Mischung enthielt 16 µM FIP- und BIP-Primer, 2 µM F3- und B3-Primer und 4 µM Loop-Primer für jedes verwendete Ziel.

Lyophilisierte Positivkontrollen wurden von GenScript erhalten und bestanden aus pUC57-Plasmiden, die entweder mit der Gen-N-, Gen-E- oder Orf1ab-Sequenz von SARS-CoV-2 in die EcoRV-Stelle kloniert waren (Tabelle S2). Positivkontrollen wurden mit hochreinem, nukleasefreiem Typ-1-Wasser auf eine Zwischenkonzentration verdünnt und dann mit der Probenlösung (unten beschrieben) gemischt, um eine Endkonzentration von 106 Kopien/μl jedes Ziels zu erreichen.

Sofern nicht anders angegeben, bestand die Probenlösung aus 10 % TE-Puffer pH 8,0 (10 mM Tris und 1 mM EDTA), 0,1 % Tween-20 und 500 μM Phenolrot. Die Probenlösung wurde der Reaktion in einem Volumen von 4 μl zugesetzt, um eine Endkonzentration von 100 μM des kolorimetrischen Farbstoffs zu erhalten.

In Experimenten, in denen wir Primer verwendeten, die auf ACTB-mRNA abzielten, wurden von geschultem Personal Nasopharyngealabstrichproben (NP) von asymptomatischen Freiwilligen entnommen. Die gesammelten Proben wurden dann in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl Probenlösung geschwenkt und 10 Minuten lang bei 95 °C thermisch inaktiviert. Alle in dieser Studie verwendeten Proben wurden unter der Unterschrift einer freien und klargestellten Einwilligungserklärung entnommen.

RT-LAMP-Reaktionen wurden, sofern nicht anders angegeben, mit einer Endkonzentration von 1,6 µM FIP- und BIP-Primern, 0,2 µM F3- und B3-Primern und 0,4 µM Loop-Primern jedes Zielgens durchgeführt. Außerdem waren 1,4 mM dNTP (1,4 mM dATP, dCTP, dGTP und 0,7 mM dTTP, dUTP), 0,4 U/μL Bst 2.0 WarmStart® DNA-Polymerase, 0,3 U/μL WarmStart® RTx Reverse Transkriptase und 0,005 U/μL Antarktis vorhanden Thermolabiles UDG, 400 mM Betain, 40 mM Guanidinhydrochlorid pH 8,0, 10 mM KCl, 8 mM MgSO4, 0,1 % (v/v) Tween-20, 100 μM Bromthymolblau und 4 μl der Probenlösung, insgesamt Reaktion von 20 μL.

Sofern nicht anders angegeben, wurde das getestete Reaktionsprotokoll auf 67 °C für 30 Minuten eingestellt. Da in der Reaktion zwei pH-Indikatoren enthalten sind – Bromthymolblau und Phenolrot – wurde ein positives oder negatives Ergebnis anhand der Farbänderung in den Röhrchen angezeigt. Im Falle einer positiven Reaktion änderte sich die anfängliche Farbe von Lila zu Gelb durch die Abnahme des pH-Werts der Reaktion, verursacht durch die Freisetzung von Protonen, wenn dNTPs in den neu synthetisierten DNA-Strang eingebaut wurden.

Um optimale Parameter für unsere kundenspezifische RT-LAMP-Formulierung zu bestimmen, wurde ein Design of Experiments-Ansatz gewählt. Wir haben uns für eine Response Surface Methodology (RSM) entschieden, um den Wert von fünf kontinuierlichen Faktoren (DNA-Polymerase, Magnesiumsulfat, Primer und Betainkonzentrationen sowie Reaktionstemperatur) und zwei kategorialen Faktoren (pH-Anpassung von Guanidinhydrochlorid [ ja/nein] und Primersequenzkombination [N/E, N/Orf1ab oder E/Orf1ab]). Hohe und niedrige Betain- und Magnesiumsulfatkonzentrationen wurden als millimolare Konzentrationen modelliert, während Primerkonzentrationen als Fraktionen aus der Standardrezeptur modelliert wurden. Die Polymerasekonzentrationen wurden als Fraktionen ab einer maximalen Konzentration von 0,8 U/μL modelliert. Die hohen und niedrigen Werte der Temperaturreaktion wurden auf + 2° oder – 2° von der ursprünglichen Temperatur von 65 °C eingestellt.

Minitab 19 wurde verwendet, um die experimentelle Matrix zu erstellen, die Laufreihenfolge zu randomisieren und die Daten zu analysieren. Für jede Bedingung verwendeten wir eine positive (1 × 106 Genomäquivalente/Reaktion) und eine negative Kontrollreaktion, um die Reaktionseffizienz und unspezifische Amplifikationsraten für jede Bedingung zu messen. Die analysierten Reaktionsfaktoren waren die Reaktionszeit (TTR), Nmax und die anfängliche Amplifikationszeit (Xt) für positive und negative Reaktionen.

Basierend auf der veröffentlichten Literatur28,29 haben wir andere pH-Indikatorfarbstoffe wie Bromthymolblau, Phenolrot, Kresolrot, Chlorphenolrot, Bromkresolpurpur, Metakresolpurpur, α-Naphtholphthalein und O-Kresolphthalein in Endkonzentrationen im Bereich von 50 bis 200 μM getestet . Stammlösungen wurden als 2 mM des Farbstoffs in 1 mM TE-Puffer hergestellt und mit hochreinem, nukleasefreiem Typ-I-Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnt. pH-Gradienten wurden durch Mischen der kolorimetrischen Farbstoffe mit entweder 1 M NaOH oder HCl erhalten.

Da unser RT-LAMP-Test pH-abhängig ist, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass der anfängliche pH-Wert der Lösung die TTR oder den Nmax der Reaktion beeinflussen könnte. Um dies zu überprüfen, haben wir den optimalen anfänglichen pH-Wert der Reaktion getestet und ihn mit 10 mM KOH auf eine Endkonzentration von 0,4–1,6 mM KOH eingestellt. Die Röhrchen enthielten Primer, die auf die Gene N und Orf1ab abzielten, sowie Positivkontrollen wie oben beschrieben.

Wir haben eine Kombination von Bromthymolblau mit Kresolrot und Phenolrot in Endkonzentrationen von 50 bis 200 μM sowohl in Proben- als auch in Reaktionslösungen getestet. Als Probe wurde ein entnommener Nasopharynxabstrich verwendet, und die Reaktionen enthielten Primer, die auf ACTB-mRNA abzielten. Nicht-Template-Kontrollen bestanden nur aus Probenlösung. Der Farbstoff wurde basierend auf der Farbänderung nach Zugabe der Probe zur LAMP-Reaktion und am Ende der positiven Reaktion ausgewählt.

Wir haben Probenlösungen mit pH-Werten im Bereich von 7 bis 9 mit einem Anstieg von 0,5 zwischen den Bedingungen vorbereitet. Für jede pH-Bedingung gab es ein Röhrchen als Negativkontrolle und ein technisches Dreifachexemplar mit Nasopharynx-Abstrichproben. Die Röhrchen enthielten Primer, die auf ACTB-mRNA abzielten.

Da unser Protokoll auf der Änderung der pH-Reaktion basierte, testeten wir die ideale Tris-Konzentration in der Endreaktion. Die in der LAMP-Reaktion verwendeten Enzyme und die Reagenzien der Probenlösung enthielten Tris in ihrer Zusammensetzung, sodass die minimale Tris-Konzentration, die in der Reaktion erreicht werden konnte, 510 μM betrug – die niedrigere getestete Konzentration – und die höchste 1000 μM (NEB). behauptet, dass sein Warmstart® RT-LAMP-Mastermix mit bis zu 1000 μM Tris funktioniert). Zu jeder Reaktion wurden unterschiedliche Volumina 10 mM Tris-Puffer hinzugefügt, um die getesteten Endkonzentrationen zu erreichen. Die Röhrchen enthielten Primer, die auf die Gene N und Orf1ab abzielten, und eine verdünnte Positivkontrolle (1000 genomische Kopien/Reaktion) wurde verwendet, um die Wirkung des Tris-Puffers zu überprüfen und gleichzeitig Proben mit niedriger Viruslast zu simulieren.

Da das Molecular Hilab®-System über keinen beheizten Deckel verfügt, kommt es zur Verdunstung der Lösung, was die Reaktionseffizienz und die Farbdatenerfassung beeinträchtigen kann. Um dieses Problem zu vermeiden, haben wir die Zugabe von 0–15 μL Mineralöl pro Reaktion getestet. Wir haben auch getestet, ob das Vorhandensein des Mineralöls die Zugabe der Probe zur Reaktionsmischung irgendwie behindern könnte, indem wir die Probe durch, über und am Boden des Öls hinzufügten und so absichtlich Blasen im Röhrchen erzeugten. Die Röhrchen enthielten Primer, die auf die Gene N und Orf1ab abzielten, und Positivkontrollen wurden wie zuvor beschrieben verwendet.

Um die Nachweisgrenze der RT-LAMP-Reaktion zu überprüfen, verwendeten wir Positivkontrollen in Konzentrationen von 10 bis 10.000 Genomäquivalenten pro Reaktion. Jeder Verdünnungspunkt wurde in 10 technischen Wiederholungen durchgeführt. Die Kontrollen wurden in der Probenlösung verdünnt und die Reaktionen wurden wie zuvor beschrieben 30 Minuten lang bei 67 °C im Hilab® Molecular-Gerät durchgeführt. Wir haben die LoD als die maximale Verdünnung festgelegt, bei der es möglich war, 100 % Positivität, also eine Verstärkung der Ziele, zu erreichen.

Zur Quantifizierung der Ergebnisse jeder optimierten Bedingung wurde intern entwickelte Software verwendet. Die Software war in der Lage, ein Tabellenblatt mit hexadezimalen Farben zu erkennen und basierend auf der Farbänderung der Reaktion ein Diagramm zu erstellen. Nachdem das Diagramm erstellt wurde, konnte der Bediener den Anfangszeitpunkt der Verstärkung (Xt) manuell festlegen, sodass die Software eine Hintergrundentfernung durchführte und mithilfe einer 4-Parameter-Polynomregression der Daten eine Sigmoidkurve erstellte. Die Software gab außerdem drei Parameter für jedes Röhrchen zurück: Nmax, der Delta-Wert der Amplifikationskurve, TTR, die Zeit zum Erreichen von 50 % des Amplifikations-Deltas, und R, der mit der Effizienz der Reaktion zusammenhängt gibt an, wie schnell die Reaktion das Plateau erreicht. In einigen Fällen haben wir auch die anfängliche Amplifikationszeit (Xt) analysiert. Diese Parameter wurden für jeden hier berichteten Test berechnet und verwendet, um zu entscheiden, welche Bedingung für jedes Experiment die beste wäre.

Das Molecular Hilab®-System wurde zur Fernüberwachung kolorimetrischer Reaktionen verwendet. Das Gerät besteht aus einem Thermoblock und einem RGB-Sensor und ist in der Lage, die Proben durch Hitze zu inaktivieren und abzukühlen, die Reaktion auf optimaler Temperatur zu halten und das Einsetzen der Reaktionsröhrchen zu erkennen. Das Einsetzen der Röhrchen in das Gerät sowie die Probenhandhabung erfolgt manuell durch den Bediener. Reaktionsdaten werden als Farbzeitreihe gesendet. Nach der Erfassung der Daten werden zwei Bilder erstellt: ein Bild mit der allmählichen Änderung der Reaktionsfarbe bis zum Ende der Reaktion und ein Diagramm, das aus der Farbänderungsreihe erstellt wurde, mit den Kurven jedes Röhrchens über die Zeit. Mit dem Gerät ist es möglich, die Farbe der Reaktionsgefäße präziser und robuster zu analysieren als beispielsweise mit dem bloßen Auge. Diese Bilder werden zusammen mit dem Anamnesefragebogen berücksichtigt, um innerhalb von 1 Minute das endgültige Ergebnis des Tests durch biomedizinische Fachkräfte zu erhalten.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor, Raddatz, WB, erhältlich.

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Bruna Winkert Raddatz, Edson Yu Sin Kim, Louise Matthew Imamura, Gisleine Jarenko Steil, Erika Bergamo James, James Peter Timm Soares, Victor Henrique Alves Ribeiro, Bernardo Montesanti Machado de Almeida, Sergio Renato Rogal Jr. und Marcus Vinicius Mazega Figueredo

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Fördermittelakquise: BMMA, MMF; Datenkuration: LMI, EYSK, BWR; Untersuchung: SWR, LMI, EYSK, GJS; Methodik: LMI, EYSK, SWR; Projektverwaltung: SWR, BMMA, EBS, SRRJ, MMF; Aufsicht: SWR, BMMA, EBS, SRRJ, MMF; Schreiben – Originalentwurf: BWR, EYSK, LMI; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: BWR, LMI, EYSK; Entwicklung von LAMP-Analysesoftware: SPTS und VHAR

Korrespondenz mit Bruna Winkert Raddatz.

Die Autoren geben die folgenden finanziellen Interessen/persönlichen Beziehungen an, die als potenziell konkurrierende Interessen angesehen werden können: MVM Figueredo ist CEO bei Hi Technologies LTDA; SR Rogal Júnior ist CTO bei Hi Technologies LTDA; BMM Almeida ist CMO bei Hi Technologies LTDA; Andere Autoren arbeiten oder arbeiteten bei Hi Technologies LTDA. Andere Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Raddatz, BW, Kim, EYS, Imamura, LM et al. Entwicklung einer optimierten kolorimetrischen RT-LAMP für den SARS-CoV-2-Assay mit verbesserten Verfahrenskontrollen für die Ferndiagnose. Sci Rep 12, 21424 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1

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Eingegangen: 13. September 2022

Angenommen: 06. Dezember 2022

Veröffentlicht: 11. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1

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