Spalthefe Srr1 und Skb1 fördern die Isochromosomenbildung am Zentromer

May 16, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 551 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Rad51 erhält die Genomintegrität aufrecht, während Rad52 eine nicht-kanonische homologe Rekombination verursacht, die zu groben chromosomalen Umlagerungen (GCRs) führt. Hier stellen wir fest, dass die Spalthefe Srr1/Ber1 und Skb1/PRMT5 GCRs an Zentromeren fördern. Genetische und physikalische Analysen zeigen, dass srr1- und skb1-Mutationen die durch Centromer-Inverted-Repeats vermittelte Isochromosomenbildung reduzieren. srr1 erhöht die DNA-Schadensempfindlichkeit in rad51-Zellen, hebt jedoch nicht die Checkpoint-Reaktion auf, was darauf hindeutet, dass Srr1 die Rad51-unabhängige DNA-Reparatur fördert. srr1 und rad52 additiv, während skb1 und rad52 GCRs epistatisch reduzieren. Im Gegensatz zu srr1 oder rad52 erhöht skb1 die Schadensempfindlichkeit nicht. Skb1 reguliert die Zellmorphologie und den Zellzyklus mit Slf1 bzw. Pom1, aber weder Slf1 noch Pom1 verursachen GCRs. Die Mutation konservierter Reste in der Arginin-Methyltransferase-Domäne von Skb1 reduziert die GCRs erheblich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Skb1 durch Argininmethylierung abweichende DNA-Strukturen bildet, die zu Rad52-abhängigen GCRs führen. Diese Studie hat die Rolle von Srr1 und Skb1 in GCRs an Zentromeren aufgedeckt.

Grobe chromosomale Umlagerungen (GCRs), wie z. B. Translokationen, können mithilfe repetitiver Sequenzen auftreten, die in eukaryontischen Genomen reichlich vorhanden und weit verbreitet sind1. Beim Menschen macht die Gesamtzahl der repetitiven Sequenzen, einschließlich Satellitenwiederholungen und transponierbarer Elemente, 54 % des Genoms aus2,3. GCRs verursachen Zelltod und genetische Störungen, einschließlich Krebs. Andererseits können GCRs eine treibende Kraft der Evolution sein, indem sie Genomvielfalt schaffen4. Daher sind GCRs nicht nur pathologische, sondern auch physiologische Phänomene.

Das Zentromer, das für die ordnungsgemäße Chromosomentrennung sorgt, enthält bei vielen Eukaryoten sich wiederholende DNA-Sequenzen. Menschliche Zentromere (≥ 3 Mb) enthalten α-Satelliten- und andere Arten von Satellitenwiederholungen, transponierbare Elemente und segmentale Duplikationen5. Die Ausrichtung der Zentromer-Wiederholungen, einschließlich Wiederholungen höherer Ordnung von α-Satelliten, ändert sich innerhalb eines Zentromers und bildet invertierte DNA-Wiederholungen. Trotz seiner wichtigen Rolle bei der Chromosomentrennung ist das Zentromer ein Hotspot für Chromosomenbrüche und -umlagerungen6,7,8,9,10. Die Rekombination zwischen sich wiederholenden Sequenzen am Zentromer führt zu abnormalen Chromosomen11,12,13. Robertsonsche Translokationen, eine Verschmelzung zweier akrozentrischer Chromosomen an oder um Zentromere, sind die am häufigsten beobachtete Form von Chromosomenanomalie beim Menschen und betreffen 1 von 1000 Neugeborenen14. Isochromosomen, deren Arme Spiegelbilder voneinander sind, kommen häufig in Krebszellen vor15. Isochromosomen von chr21 und chrX verursachen das Down- bzw. Turner-Syndrom16,17. Im Vergleich zu Säugetier-Zentromeren sind die Zentromere der Spalthefe S. pombe kurz (35–110 kb), enthalten jedoch invertierte DNA-Wiederholungen, die eine nicht-repetitive Kernsequenz flankieren18,19. Bei diesem Pilz werden Isochromosomen mithilfe invertierter DNA-Wiederholungen im Zentromer hergestellt20,21,22. Die geringere Komplexität der Zentromer-DNA-Sequenz macht Spalthefe zu einem hervorragenden System zur Untersuchung des Mechanismus zentromerer GCRs.

Um schädliche DNA-Schäden wie Doppelstrangbrüche zu reparieren, ist eine homologe Rekombination erforderlich23. Rad51 ist der Schlüsselakteur bei der kanonischen homologen Rekombination und katalysiert die Homologiesuche und den DNA-Strangaustausch, wodurch Verdrängungsschleifen gebildet werden. BRCA1 und BRCA2 von Säugetieren erleichtern die Rad51-abhängige Rekombination, und ihre Mutationen erhöhen die GCRs und prädisponieren die Träger für Krebs24,25. Durch die homologe Rekombination bleibt die Zentromerintegrität erhalten. Bei Säugetieren erhöht die Inaktivierung von Rad51 die aberrante Rekombination an Zentromeren9,10,26. In Spalthefe erhöht der Verlust von Rad51 die Isochromosomenbildung an Zentromeren20,21,27. Eine detaillierte Analyse mit Spalthefe zeigte, dass Rad51 bevorzugt eine konservative Art der Rekombination fördert: die Nicht-Crossover-Rekombination an Zentromeren27,28, wodurch die Isochromosomenbildung unterdrückt wird.

Eine weitere Rekombinase, Rad52, fördert die homologieabhängige DNA-Rekombination/Reparatur unabhängig von Rad5129,30. Rad52 allein fördert die Bildung von Verdrängungsschleifen, das Single-Strang-Annealing (SSA) und den inversen Strangaustausch mithilfe von RNA-Strängen. Hefe-Rad52 erleichtert auch das Laden von Rad51 auf mit Replikationsprotein A (RPA) beschichtete einzelsträngige DNA, während menschliches Rad52 nicht über die Loader-Aktivität verfügt31. Sowohl bei Säugetieren als auch bei Spalthefen führt die Rad52-abhängige nicht-kanonische Rekombination zu GCRs an Zentromeren9,32. In Spalthefe verursacht Rad52 die Bildung von Isochromosomen durch Crossover-Rekombination mit Mus81, einer Crossover-spezifischen Endonuklease27,32,33,34,35. PCNA-Ubiquitinierung an Lysin 107 und Msh2-Msh3 wurde mit dem Rad52-abhängigen GCR-Signalweg in Verbindung gebracht32,36. Die DNA-Gleitklemme PCNA kann DNA-Strukturen bilden, die zu Rad52-abhängigen GCRs führen, da PCNA K107 für die Reparatur von DNA-Schäden entbehrlich ist36. Die rad52-Deletion beseitigt nicht die Isochromosomenbildung, was auf das Vorhandensein eines oder mehrerer Rad52-unabhängiger GCR-Wege schließen lässt. Darüber hinaus bleibt das ursprüngliche Ereignis, das zu GCRs führt, unklar.

Um Einblicke in den GCR-Mechanismus zu gewinnen, suchen wir nach den Faktoren, die GCRs im rad51Δ-Mutantenstamm verursachen, und finden Srr1 und Skb1. Bei A. thaliana und Mäusen beeinflusst das Srr1-Homolog die Transkription der Gene, die am zirkadianen Rhythmus beteiligt sind37,38,39. Skb1 ist an einer Reihe von Signalwegen beteiligt, einschließlich der Zellmorphologie und der Regulierung des Zellzyklus in Spalthefe40,41,42,43, und ist das Homolog des menschlichen Proteins Arginin-Methyltransferase 5 (PRMT5)44,45. Srr1 und Skb1 fördern spezifisch die Isochromosomenbildung. Bemerkenswerterweise erhöht die srr1-Mutation die Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden und den Chromosomenverlust, ist jedoch für die Checkpoint-Reaktion auf DNA-Schäden nicht wesentlich, was darauf hindeutet, dass Srr1 die Reparatur von DNA-Schäden fördert. srr1- und rad52-Mutationen reduzierten zusätzlich die GCR-Raten, was darauf hindeutet, dass Srr1 und Rad52 überlappende und nicht überlappende Rollen in GCRs spielen. Im Gegensatz zu srr1 erhöht die skb1-Deletion nicht die Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden und verringert interessanterweise den Chromosomenverlust in rad51Δ-Zellen. Der Verlust von Slf140,41 oder Pom142,43, die mit Skb1 in der Zellmorphologie und Zellzyklusregulation zusammenarbeiten, führte nicht zu einer Verringerung der GCRs. Die Mutation konservierter Reste in der Arginin-Methyltransferase (RMTase)-Domäne von Skb1 reduzierte jedoch die GCRs stark, was darauf hindeutet, dass Skb1 durch seine RMTase-Aktivität die Bildung von Isochromosomen verursacht. Diese Erkenntnisse ebnen neue Wege zur Entschlüsselung des Mechanismus von GCR-Ereignissen am Zentromer.

Um Einblicke in den Mechanismus von GCRs zu gewinnen, führten wir zufällige Mutationen in rad51Δ-Zellen ein, die erhöhte GCR-Raten aufweisen, und suchten nach Klonen, die verringerte GCR-Spiegel aufweisen. Um ansonsten tödliche GCRs in haploiden Zellen nachzuweisen, verwendeten wir einen extra-chromosomalen ChLC (~530 kb), der vom Spalthefe-Chromosom 3 (chr3) abgeleitet war, und entdeckten spontane GCRs, die die Markergene ura4+ und ade6+ verloren hatten (Abb. 1a)20,27 ,46. Um die GCR-Raten zu bewerten, wurden Hefeklone, die auf mit Uracil und Adenin (EMM+UA) ergänzten Edinburgh-Minimummedien gezüchtet wurden, auf Medien repliziert, die 5-Fluororotsäure (5-FOA+UA) enthielten, die für ura4+-Zellen toxisch ist. Von 24.000 Klonen zeigten drei reproduzierbar verringerte GCR-Werte. Die Genomsequenzierung eines von ihnen identifizierte die Mutationen srr1/ber1-W157R und skb1-A377V in ihren SRR1-ähnlichen bzw. Arginin-Methyltransferase (RMTase)-Domänen (Abb. 1b). Die Gene srr1 und skb1 sind auf chr2 nur 51 kb voneinander entfernt. Der Replika-Plattierungstest zeigt, dass der rad51Δ-Klon, der die srr1- und skb1-Mutationen enthält, im Vergleich zum Elternstamm rad51Δ aus der reduzierten Anzahl von Kolonien auf der 5-FOA+UA-Platte stammt (Abb. 1c).

a Abgebildet ist ein extra-chromosomales ChLC, das in dieser Studie zum Nachweis von GCRs verwendet wird. GCRs, die aus Leu+ Ura+ Ade+ zu Leu+ Ura– Ade– führten, wurden nachgewiesen. b Srr1/Ber1- und Skb1-Proteine ​​enthalten die SRR1-ähnliche Domäne bzw. die Arginin-Methyltransferase (RMTase)-Domäne. Aneinandergereiht sind die Aminosäuresequenzen um die Mutationen srr1-W157R und skb1-A377V (blaue Kreise) in verschiedenen Arten. Ähnliche und identische Rückstände zwischen den verschiedenen Arten werden in Hell- bzw. Dunkelgrau hervorgehoben. c Der Elternstamm rad51∆ und der Klon, der zusätzlich die Mutationen srr1-W157R und skb1-A377V (TNF5411 und 5954) enthielt und auf EMM+UA gewachsen war, wurden auf 5-FOA+UA-Platten repliziert. Leu+ Ura–-Zellen bilden selektiv Kolonien auf 5-FOA+UA-Platten. d GCR-Raten der Wildtyp-, srr1∆-, skb1∆-, rad51∆-, srr1∆ rad51∆-, skb1∆ rad51∆- und srr1∆ skb1∆ rad51∆-Stämme (TNF5369, 5774, 5772, 5411, 5904, 5788 und 8432 ). e GCR-Raten von Wildtyp, rad51∆, srr1∆ rad51∆, srr1-W157R rad51∆ (TNF8344), skb1∆ rad51∆, skb1-A377V rad51∆ (TNF8359) und srr1-W157R skb1-A377V rad51∆ (TNF8547 ). Jeder Punkt stellt einen Wert dar, der aus einem unabhängigen Experiment ermittelt wurde. Schwarze Linien zeigen den Median. Die relativen Raten zum Wildtyp werden über jedem Punktcluster angezeigt. Der zweiseitige Mann-Whitney-Test zwischen Wildtyp- und Mutantenstämmen sowie zwischen den angegebenen Paaren. ns, nicht signifikant; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****, p < 0,0001. Numerische Daten, die den Diagrammen d und e zugrunde liegen, sind in Tabelle A in den Zusatzdaten 1 aufgeführt.

Um festzustellen, ob Srr1 oder Skb1 für GCRs erforderlich ist, haben wir die Gene gelöscht und die GCR-Raten mithilfe des Fluktuationstests bestimmt (Abb. 1d). Im Wildtyp-Hintergrund verringerte srr1Δ, jedoch nicht skb1Δ die GCR-Raten leicht, was zeigt, dass Srr1 auch in Gegenwart von Rad51 für GCRs erforderlich ist. Zu unserer Überraschung reduzierte nicht nur srr1Δ, sondern auch skb1Δ die GCR-Raten im rad51Δ-Hintergrund, was zeigt, dass sowohl Srr1 als auch Skb1 GCRs verursachen. Bemerkenswerterweise reduzierte die Doppelmutation srr1Δ skb1Δ die GCRs weiter als die Einzelmutationen, was darauf hindeutet, dass Srr1 und Skb1 nicht überlappende Rollen in GCRs spielen (siehe unten). Um festzustellen, ob die Punktmutationen srr1-W157R und skb1-A377V die GCR-Raten senken, haben wir jede Mutation durch Transformation in Hefe eingeführt (siehe Methoden) und die GCR-Raten im rad51Δ-Hintergrund bestimmt (Abb. 1e). srr1-W157R reduzierte die GCR-Raten, wenn auch weniger ausgeprägt als srr1Δ, was auf eine Restaktivität des mutierten Srr1-Proteins schließen lässt. Im Gegensatz zu skb1Δ reduzierte skb1-A377V die GCR-Raten in srr1+ rad51Δ-Zellen nicht signifikant. Allerdings reduzierte skb1-A377V die GCR-Raten in srr1-W157R rad51Δ-Zellen, was darauf hindeutet, dass skb1-A377V die Skb1-Funktion teilweise inaktiviert. Der additive Effekt von srr1-W157R und skb1-A377V auf die GCR-Raten kann erklären, warum unser genetisches Screening beide Mutationen im selben Klon identifizierte. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Vorstellung, dass Srr1 und Skb1 in GCRs keine überlappenden Rollen spielen.

Keimende Hefezellen vom Typ srr1/ber1Δ (benomylresistent) sind hyperresistent gegenüber Mikrotubuli-destabilisierenden Benzimidazolverbindungen: Benomyl und Nocodazol39. Spalthefe-srr1Δ-Zellen waren jedoch gegenüber Thiabendazol (TBZ), dem in diesem Pilz am häufigsten verwendeten Benzimidazol, nicht resistenter als Wildtypzellen (ergänzende Abbildung 1). Auf dieser Grundlage haben wir beschlossen, dieses Gen srr1 statt ber1 zu nennen, um Verwirrung zu vermeiden.

Frühere Studien zeigten, dass rad51Δ-Zellen Isochromosomen und relativ wenige Chromosomenverkürzungen produzieren27,32,36. Isochromosomen werden durch invertierte DNA-Wiederholungen am Zentromer erzeugt, während chromosomale Verkürzungen durch die De-novo-Anfügung von Telomersequenzen an neue Chromosomenenden entstehen (Abb. 2a). Isochromosomen (300–400 kb) und Verkürzungen (< 220 kb) werden durch ihre Länge voneinander unterschieden. Um zu bestimmen, welche GCRs Srr1 und Skb1 verursachen, wurden chromosomale DNAs der Eltern- und unabhängigen GCR-Klone in Agarosepfropfen präpariert, durch Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) getrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt (Abb. 2b). Die Größen der GCR-Produkte wurden unter Verwendung des parentalen ChLC (530 kb) und der Lambda (λ)-DNA-Leiter als Referenzen bestimmt. rad51Δ-Zellen produzierten viele Isochromosomen (300–400 kb) und eine kleine Anzahl an Verkürzungen (< 220 kb), wie zuvor beobachtet20,27,32,36. Der Verlust von Srr1 oder Skb1 verringerte den Anteil der Isochromosomen unter den GCR-Produkten. Die gesamten GCR-Raten wurden mit dem Anteil der Isochromosomen oder Verkürzungen multipliziert (Tabelle 1), um die Raten der Isochromosomen bzw. Verkürzungen zu erhalten (Abb. 2c). Entweder srr1Δ oder skb1Δ eliminierten etwa 90 % der in rad51Δ-Zellen gebildeten Isochromosomen, aber keines von beiden reduzierte die Verkürzungen der Chromosomen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Srr1 und Skb1 speziell für die Isochromosomenbildung am Zentromer erforderlich sind.

a Abgebildet sind die sich nicht wiederholenden (cnt3) und sich wiederholenden Sequenzen (das innerste imr3, dg, dh und das äußerste irc3) in cen3. Das ura4+-Markergen wird 10 kb von cen3 entfernt platziert. Der Verlust von Rad51 erhöht die Zahl der Isochromosomen und Chromosomenverkürzungen. b Chromosomale DNAs, die aus den Eltern- (P) und unabhängigen GCR-Klonen der Stämme rad51∆, srr1∆ rad51∆ und skb1∆ rad51∆ (TNF5411, 5904 und 5788) hergestellt wurden, wurden durch PFGE getrennt. Die Größen der Lambda (λ)-DNA-Leitern sind links in den Feldern angegeben. Die Probenzahlen der Isochromosomen und Verkürzungen werden in Blau bzw. Magenta angezeigt. c Raten der Isochromosomenbildung und Chromosomenverkürzung in den Stämmen Wildtyp (TNF5369), rad51∆, srr1∆ rad51∆, skb1∆ rad51∆ und skb1-F319Y rad51∆ (TNF8391). Die Raten relativ zur rad51∆-Belastung sind oben in den Balken angegeben. Der zweiseitige exakte Fischer-Test zwischen rad51∆ und anderen Mutantenstämmen. **p < 0,01; ****p < 0,0001. Numerische Daten, die c zugrunde liegen, sind in Tabelle B in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Unbeschnittene Gelbilder sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.

Da Srr1 und Skb1 die durch Zentromerwiederholungen vermittelte Isochromosomenbildung fördern, könnten sie an der rekombinationsbedingten Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sein. Um diese Möglichkeit zu testen, führten wir einen seriellen Verdünnungstest durch und bestimmten die Empfindlichkeit der Mutantenstämme srr1 und skb1 gegenüber DNA-schädigenden Wirkstoffen (Abb. 3a). Methylmethansulfonat (MMS) ist ein DNA-Alkylierungsmittel; Hydroxyharnstoff (HU) erschöpft den dNTP-Pool; Camptothecin (CPT) ist ein Topoisomerase-Inhibitor. Diese Wirkstoffe stören den Fortschritt der Replikationsgabeln und verursachen DNA-Brüche. Im Vergleich zum Wildtyp zeigten srr1Δ-Zellen eine Überempfindlichkeit gegenüber allen DNA-schädigenden Wirkstoffen (Abb. 3a, obere Felder). Bemerkenswerterweise waren srr1Δ-rad51Δ-Zellen empfindlicher als die einzelnen Mutanten, was auf eine Rolle von Srr1 bei der Rad51-unabhängigen DNA-Schadensreaktion schließen lässt. Die srr1-W157R-Mutation, die die GCR-Raten teilweise reduzierte (Abb. 1e), erhöhte teilweise auch die Schadensempfindlichkeit. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Srr1 die Rad51-unabhängige DNA-Schadensreaktion erleichtert.

a Ein serieller Verdünnungstest zur Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Stoffen. Logphasenkulturen von Wildtyp, SRR1-W157R, SRR1 & Dgr;, Rad51 & Dgr;, SRR1-W157R Rad51 & Dgr; und srr1 & Dgr; rad51 & Dgr; die angegebenen Konzentrationen von MMS, HU oder CPT (obere Felder). Log-Phase-Kulturen von Wildtyp, skb1Δ, rad51Δ und skb1Δ rad51Δ (TNF35, 8321, 8107 und 8320), hergestellt in YE-Medium, wurden auf YE-Platten (untere Tafeln) getupft. b Wildtyp-, srr1Δ-, skb1Δ- und chk1Δ-Zellen (TNF35, 5943, 8321 und 3559) in der logarithmischen Phase in EMM wurden mit 0,01 % MMS behandelt. Der Prozentsatz der Zellen, die ein Septum enthalten, ist angegeben. An jedem Punkt werden > 300 Zellen gezählt. Pearsons Chi-Quadrat-Test des Septationsindex zwischen Wildtyp und anderen Stämmen bei t = 8 Stunden zeigte, dass srr1Δ oder skb1Δ den Septationsindex nicht signifikant veränderten (p > 0,05), chk1Δ ihn jedoch erhöhte. c Chk1-Phosphorylierung als Reaktion auf die MMS-Behandlung. Vor und nach 4-stündiger Behandlung mit 0,01 % MMS wurden Extrakte aus chk1+- (TNF7555) und chk1-HA+-Zellen des Wildtyps, srr1Δ und skb1Δ (TNF8441, 8799 und 8802) hergestellt und durch 8 % SDS-PAGE aufgetrennt. Chk1-HA wurde durch Western Blot unter Verwendung von Anti-HA-Antikörpern (16B12) nachgewiesen. Ganze Proteine ​​wurden mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Links sind Größenmarkierungen (Takara, 3454 A, KLAR gefärbte Proteinleiter) abgebildet. wt, Wildtyp. Unbeschnittene Bilder sind in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. d Wildtyp- und srr1Δ-Zellen (TNF5369 und 5774) wurden auf adeninlimitierte YE-Platten ausplattiert, auf denen ade6–-Zellen rote Kolonien bilden. e Chromosomenverlustraten der Wildtyp-, srr1Δ-, srr1-W157R-, skb1Δ-, rad51Δ-, srr1-W157R rad51Δ- und skb1Δ rad51Δ-Stämme (TNF5369, 5774, 8308, 5772, 5411, 8344 und 5788). Der zweiseitige Mann-Whitney-Test. **p < 0,01; ***p < 0,001. Numerische Daten, die b, e zugrunde liegen, sind in den Tabellen C bzw. D in den Zusatzdaten 1 aufgeführt.

Der durch einen DNA-Schaden-Checkpoint verursachte Stillstand des Zellzyklus gibt den Zellen Zeit, die DNA zu reparieren. Um festzustellen, ob Srr1 erforderlich ist, um das Fortschreiten des Zellzyklus als Reaktion auf DNA-Schäden zu stoppen, haben wir den Prozentsatz der septierten Zellen vor und nach der MMS-Exposition bestimmt (Abb. 3b). Im Wildtyp sank der Septationsindex nach MMS-Exposition von etwa 30 auf 5 %, was auf einen durch MMS induzierten Zellzyklusstopp hindeutet. Die Checkpoint-Kinase Chk1 ist für den Stillstand des Zellzyklus erforderlich47. Beim chk1Δ-Stamm sank der Septationsindex nicht auf das Wildtyp-Niveau. Im Gegensatz zu chk1Δ sank der Septationsindex im Stamm srr1Δ 6 Stunden nach der MMS-Zugabe auf das Wildtyp-Niveau, was darauf hindeutet, dass Srr1 für den Stillstand des Zellzyklus entbehrlich ist. Eine Verzögerung bei der Reduktion septierter Zellen kann auf das langsame Wachstum des srr1Δ-Stamms zurückzuführen sein. Die Verdopplungszeit von Wildtyp- und srr1Δ-Zellen, die in EMM-Medien bei 30 °C gezüchtet wurden, betrug 2,48 ± 0,11 bzw. 2,73 ± 0,10 h (p = 0,042, der zweiseitige Student-t-Test) (Tabelle E in Supplementary Data 1). ). Wie Wildtyp-Zellen wurden srr1Δ-Zellen nach MMS-Exposition verlängert (ergänzende Abbildung 2a). Diese Daten legen nahe, dass Srr1 für den durch DNA-Schäden verursachten Zellzyklusstopp entbehrlich ist. Chk1-Kinase wird als Reaktion auf DNA-Schäden phosphoryliert und aktiviert48,49. Um zu bestimmen, ob Srr1 für die Chk1-Phosphorylierung erforderlich ist, wurde HA-markiertes Chk1-HA vom ursprünglichen chromosomalen Locus exprimiert, durch SDS-PAGE getrennt und unter Verwendung von Anti-HA-Antikörpern nachgewiesen (Abb. 3c). Eine langsam wandernde Chk1-HA-Bande, die auf die Phosphorylierung hinweist, wurde bei der MMS-Behandlung sowohl bei Wildtyp- als auch bei srr1Δ-Stämmen beobachtet, was zeigt, dass Srr1 für die Aktivierung des DNA-Schadens-Checkpoints nicht essentiell ist.

Die Reparatur spontaner DNA-Schäden ist für den Erhalt der Chromosomen von entscheidender Bedeutung. Um festzustellen, ob Srr1 zur Aufrechterhaltung der Chromosomen erforderlich ist, haben wir die Spontanverlustraten von ChLC mithilfe des Fluktuationstests ermittelt. Eine auf YE3S-Platten gebildete Kolonie wurde in sterilisiertem Wasser suspendiert und die Zellen auf adeninlimitierte YE-Platten ausplattiert, auf denen Zellen ohne ade6+ rote Kolonien bildeten (Abb. 3d). Die roten Kolonien wurden weiter auf Leu- und Ura-Auxotrophie untersucht, um die Chromosomenverlustrate (dh Leu-Ura-Ade-) zu ermitteln (Abb. 3e). Wir fanden heraus, dass srr1Δ und srr1-W157R die Chromosomenverlustrate erhöhten. rad51Δ erhöht auch den Chromosomenverlust, wie bereits zuvor beobachtet32. Bemerkenswert ist, dass srr1-W157R und rad51Δ synergistisch den Chromosomenverlust erhöhten, was zeigt, dass Srr1 und Rad51 unterschiedliche Rollen bei der Aufrechterhaltung der Chromosomen spielen.

Im Gegensatz zu den srr1-Mutationen erhöhte skb1Δ weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von Rad51 die Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Mitteln (Abb. 3a, untere Felder), was zeigt, dass Skb1 für die Reparatur von durch MMS, HU, induzierten DNA-Schäden entbehrlich ist. oder CPT. Skb1 war auch für den Stillstand des Zellzyklus und die durch MMS-Behandlung induzierte Chk1-Phosphorylierung entbehrlich (Abb. 3b, c). Interessanterweise reduzierte skb1Δ jedoch den Chromosomenverlust in rad51Δ-Zellen stark (Abb. 3e), was zeigt, dass Skb1 die Bildung von Isochromosomen und den Chromosomenverlust in rad51Δ-Zellen verursacht.

Rad52 fördert die Isochromosomenbildung in rad51Δ-Zellen. Die rad52-R45K-Mutation in der N-terminalen DNA-Bindungsdomäne beeinträchtigt insbesondere die In-vitro-Einzelstrang-Annealing-Aktivität (SSA) und reduziert die Isochromosomenbildung im gleichen Ausmaß wie rad52Δ32, was auf eine Rolle der Rad52-vermittelten SSA bei der Isochromosomenbildung schließen lässt. Die Mutationen rad52-R45K, rad52Δ und srr1Δ eliminieren etwa 90 % der Isochromosomen in rad51Δ-Zellen (Abb. 2c und Lit. 32), was darauf hinweist, dass sowohl Rad52 als auch Srr1 für den Hauptweg der Isochromosomenbildung essentiell sind. Um die Beziehung zwischen Srr1 und Rad52 zu definieren, haben wir die srr1-rad52-Doppelmutanten erstellt und die GCR-Raten bestimmt (Abb. 4a). Bemerkenswert ist, dass srr1Δ und rad52-R45K die GCR-Raten im Wildtyp-Hintergrund additiv reduzierten, was darauf hindeutet, dass Srr1 und Rad52 auch nicht überlappende Rollen in GCRs spielen. In Übereinstimmung mit dieser Idee reduzierten srr1-W157R und rad52-R45K die GCR-Raten im rad51Δ-Hintergrund additiv. Die Ubiquitinierung von PCNA (kodiert durch das pcn1-Gen) an Lysin 107 (K107) spielt eine Rolle bei Rad52-abhängigen GCRs36. Wie erwartet reduzierten srr1-W157R und pcn1-K107R zusätzlich die GCR-Raten in rad51Δ-Zellen (Abb. 4a). Diese Daten zeigen, dass Srr1 und Rad52 in GCRs sowohl überlappende als auch nicht überlappende Rollen spielen.

a GCR-Raten von Wildtyp, srr1∆, rad52-R45K, srr1∆ rad52-R45K, rad51∆, srr1-W157R rad51∆, rad52-R45K rad51∆, srr1-W157R rad52-R45K rad51∆, pcn1- K107R rad51∆ und srr1-W157R pcn1-K107R rad51∆-Stämme (TNF5369, 5774, 6599, 8281, 5411, 8344, 7122, 8663, 6761 und 8601). Der zweiseitige Mann-Whitney-Test. b Tetradenanalyse von srr1∆ und rad52∆. srr1::kanR- und rad52::hygR-Haploide (TNF5943 und 7988) wurden gekreuzt und die resultierenden Tetraden wurden auf YE-Platten unter einem Mikroskop präpariert. Es werden Bilder von drei Sätzen lebensfähiger Tetraden mit drei Sporen gezeigt, in denen die srr1::kanR rad52::hygR-Nachkommen keine Kolonien bildeten. c Die Erschöpfung von Rad52 durch das AID-System beeinträchtigt das Wachstum von srr1∆-Zellen. rad52-AID, srr1∆ rad52-AID, OsTIRF74A, srr1∆ OsTIRF74A, rad52-AID OsTIRF74A und srr1∆ rad52-AID OsTIRF74A (TNF8614, 8621, 8616, 8623, 8617 und 8627). gefleckt auf YE-Platten, ergänzt mit 200 nM 5'a-IAA, das die Rad52-Depletion induziert. d Rpa2-mCherry-Herde (Pfeilspitze) wurden durch Fluoreszenzmikroskopie in Wildtyp-Zellen (TNF5492) beobachtet. Fluoreszenz- und DIC-Bilder werden überlagert. DIC, differenzieller Interferenzkontrast. Ein unter dem Bild angezeigter Balken zeigt 10 µm an. Das Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der Kerne, die mindestens einen Rpa2-mCherry-Fokus in Wildtyp- und srr1∆ (TNF8803)-Stämmen enthalten. Die Balken stellen den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten dar. Der zweiseitige Student-T-Test. Die Rad52-GFP-Herde (Pfeilspitze) wurden in Wildtyp-Zellen (TNF4442) beobachtet. Das Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der Kerne, die mindestens einen Rad52-GFP-Fokus in Wildtyp- und srr1∆ (TNF6130)-Stämmen enthalten. Numerische Daten, die a zugrunde liegen, sind in Tabelle A aufgeführt, und diejenigen, die d und e zugrunde liegen, sind in Tabelle F in den Zusatzdaten 1 aufgeführt.

Wir kreuzten die haploiden Stämme srr1Δ und rad52Δ und sezierten die Tetraden, konnten jedoch keine srr1Δ rad52Δ-Nachkommen erhalten (Abb. 4b), was auf synthetische Wachstumsdefekte der doppelten Deletion von srr1 rad52 schließen lässt. Um dies zu bestätigen, haben wir Rad52 in srr1Δ-Zellen mithilfe des Auxin-induzierten Degron-2-Systems (AID2) abgereichert. In Gegenwart des F-Box-Proteins OsTIR1F74A induziert ein Auxin-Analogon 5'-Adamantyl-IAA (5'a-IAA) den Polyubiquitin-abhängigen Abbau des AID-markierten Rad52-Proteins Rad52-AID. Die Zugabe von 5'a-IAA zu den Medien beeinträchtigte das Zellwachstum des srr1Δ rad52-AID im Vergleich zum rad52-AID-Stamm erheblich (Abb. 4c, letzte zwei Reihen). Diese Ergebnisse zeigen nicht überlappende Rollen von Srr1 und Rad52 beim Zellwachstum. Angesichts der Überempfindlichkeit von srr1Δ-Zellen gegenüber DNA-schädigenden Wirkstoffen (Abb. 3a) kann Srr1 die Reparatur spontaner DNA-Schäden fördern. Einzelsträngige DNA entsteht während der Replikation, Transkription und Reparatur/Rekombination von DNA-Schäden. Der Replikationsprotein A (RPA)-Komplex bindet einzelsträngige DNA mit hoher Affinität52. Wir entdeckten die spontane Fokusbildung von Rpa2-mCherry, die vom ursprünglichen chromosomalen Locus32 exprimiert wurde, und stellten fest, dass srr1Δ den Anteil der Zellen erhöhte, die den Rpa2-mCherry-Fokus enthielten (Abb. 4d), was auf die Akkumulation einzelsträngiger DNA in srr1Δ-Zellen schließen lässt. Rad52 bildet Kernherde an spontanen DNA-Schadensstellen27,53. srr1Δ erhöhte auch den Rad52-GFP-Fokus der Zellen (Abb. 4e), was zeigt, dass Srr1 die Rad52-Fokusbildung unterdrückt.

Srr1 hat eine evolutionär konservierte Domäne, die SRR1-ähnliche Domäne genannt wird (Abb. 5a). Die durch AlphaFold-Methoden vorhergesagte Struktur des Srr1-Proteins54,55 besteht aus der SRR1-ähnlichen Domäne, die β-Faltblätter enthält, die von α-Helixen mit intrinsisch ungeordneten Erweiterungen56 sowohl am N- als auch am C-Terminus umgeben sind (Abb. 5b, c). Die srr1-W157R-Mutationsstelle ist in der SRR1-ähnlichen Domäne vorhanden. Um dies zu erweitern, haben wir konservierte Reste in der SRR1-ähnlichen Domäne in Alanin geändert: srr1-D111A, P112A und srr1-H148A (Abb. 5a, b). Sowohl die Mutationen srr1-D111A, P112A als auch srr1-H148A reduzierten die GCR-Raten (Abb. 5d). srr1-D111A, P112A und srr1-H148A erhöhten auch die Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden (Abb. 5e). Diese Ergebnisse zeigen, dass die SRR1-ähnliche Domäne eine wesentliche Rolle bei GCRs und der Reparatur von DNA-Schäden spielt. Wie aufgrund der verlängerten Verdopplungszeit zu erwarten war (Tabelle E in den Zusatzdaten 1), bildeten srr1Δ-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen kleine Kolonien auf Plattenmedien (Ergänzungsabbildung 2b). Wie srr1Δ-Zellen produzierten srr1-W157R-, srr1-D111A-, P112A- und srr1-H184A-Zellen kleine Kolonien (ergänzende Abbildung 2b), was mit der Rolle der SRR1-ähnlichen Domäne auch ohne exogenen DNA-Schaden übereinstimmt.

a Die Positionen der Spalthefe-Mutationsstellen srr1-D111A, P112A, -H148A und -W157R sind durch blaue Kreise gekennzeichnet. Ähnliche und identische Rückstände zwischen den verschiedenen Arten werden in Hell- bzw. Dunkelgrau hervorgehoben. b Ein Bandmodell der Srr1-Struktur, vorhergesagt durch AlphaFold-Methoden. Die Positionen der Mutationsstellen sind angegeben. c Ein Oberflächenmodell der Srr1-Struktur. Positiv und negativ geladene Reste werden in Blau bzw. Rot dargestellt. d GCR-Raten von Wildtyp, rad51∆, srr1∆ rad51∆, srr1-W157R rad51∆, srr1-D111A,P112A rad51∆ und srr1-H148A rad51∆ (TNF5369, 5411, 5904, 8344, 8686 und 8387) . Der zweiseitige Mann-Whitney-Test. Numerische Daten finden Sie in Tabelle A in den Zusatzdaten 1. e Die Mutation der konservierten Reste in der SRR1-ähnlichen Domäne erhöht die Empfindlichkeit gegenüber MMS, HU und CPT. Wildtyp-, srr1∆-, srr1-W157R-, srr1-H148A- und srr1-D111A-, P112A-Zellen (TNF3885, 5847, 8280, 8275 und 8274) wurden auf YE3S getupft, ergänzt mit den angegebenen Konzentrationen von MMS, HU oder CPT .

Skb1 ist an einer Vielzahl von Signalwegen beteiligt, darunter an der Zellmorphologie und der Regulierung des Zellzyklus. Skb1 interagiert mit Slf1 und lokalisiert sich je nach Slf1 in kortikalen Zellknoten, wodurch die stäbchenförmige Zellmorphologie der Spalthefe gefördert wird40,41. Die Kinase Pom1 der DYRK-Familie reguliert den Zellzyklus negativ, um sicherzustellen, dass die Zellen eine bestimmte Größe erreichen, bevor sie in die Mitose eintreten42. Genetische Beweise zeigen, dass Skb1 im Pom1-Signalweg fungiert, um den Zellzyklus unabhängig von seiner Methyltransferase-Aktivität zu regulieren43. Um zu fragen, ob Skb1 die Isochromosomenbildung über diese Wege fördert, haben wir die Gene slf1 oder pom1 gestört und die GCR-Raten der Mutantenstämme bestimmt (Abb. 6a). Im Gegensatz zu skb1Δ erhöhten slf1Δ und pom1Δ die GCR-Raten im Wildtyp-Hintergrund leicht und verringerten die GCR-Raten im rad51Δ-Hintergrund nicht, was zeigt, dass Skb1 die Isochromosomenbildung durch die von Slf1 oder Pom1 unabhängige Funktion fördert.

a GCR-Raten der Wildtyp-, skb1∆-, slf1∆-, pom1∆-, rad51∆-, skb1∆ rad51∆-, slf1∆ rad51∆- und pom1∆ rad51∆-Stämme (TNF5369, 5772, 8811, 8813, 5411, 578). 8, 8834 , und 8838). b Dargestellt sind die mit AlphaFold-Methoden vorhergesagte Struktur der Arginin-Methyltransferase-Domäne der Spalthefe S. pombe Skb1 und die Kristallstruktur der Arginin-Methyltransferase-Domäne von C. elegans PRMT5 (PDB-Code 3UA3) mit SAH, einem SAM-Analogon. Die Positionen der für die Arginin-Methyltransferase-Aktivität wesentlichen Phenylalanin- (F) und Glutaminsäure- (E) Reste sind angegeben. c GCR-Raten der Wildtyp-, rad51∆-, skb1∆ rad51∆-, skb1-A377V rad51∆-, skb1-F319Y rad51∆- und skb1-E422A, E431A rad51∆-Stämme (TNF5369, 5411, 5788, 8359, 8 391 und 8474 ). d PFGE trennte GCR-Produkte des Stammes skb1-F319Y rad51∆. Die Probenzahlen der Isochromosomen und Verkürzungen werden in Blau bzw. Magenta angezeigt. e GCR-Raten der Wildtyp-, skb1∆-, rad52-R45K-, skb1∆ rad52-R45K-, rad51∆-, skb1∆ rad51∆-, rad52-R45K rad51∆- und skb1∆ rad52-R45K rad51∆-Stämme (TNF5369, 57 72, 6599 , 8324, 5411, 5788, 7122 und 8345). Der zweiseitige Mann-Whitney-Test. Numerische Daten, die a, c und e zugrunde liegen, sind in Tabelle A in den Zusatzdaten 1 aufgeführt. Unbeschnittene Gelbilder sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.

Skb1 ist das Homolog der PRMT5-Arginin-Methyltransferase (RMTase)44,45. Die mit AlphaFold-Methoden vorhergesagte RMTase-Domänenstruktur von S. pombe Skb154,55 ist der Kristallstruktur der PRMT5-RMTase-Domäne von C. elegans (Abb. 6b) und den vorhergesagten Strukturen von H. sapiens, A. thaliana und S. sehr ähnlich . cerevisiae Skb1/PRMT5-Homologe (ergänzende Abbildung 3). Die von uns isolierte skb1-A377V-Mutation ist in der RMTase-Domäne vorhanden (Abb. 1b, 6b), der mutierte Phänotyp war jedoch nicht so ausgeprägt wie der von skb1Δ (Abb. 6c). Um festzustellen, ob die RMTase-Aktivität für Skb1 zur Förderung der Isochromosomenbildung wesentlich ist, haben wir die Skb1-Reste F319, E422 und E431 mutiert, die denen entsprechen, die für die In-vitro-RMTase-Aktivität von C. elegans PRMT557 wichtig sind. Wir fanden heraus, dass die Mutationen skb1-F319Y und skb1-E422A, E431A die GCR-Raten in rad51Δ-Zellen stark reduzierten (Abb. 6c). Wichtig ist, dass die gleiche skb1-E422A,E431A-Mutation ihre Rolle bei der Zellzyklusregulation nicht beeinträchtigt43. Die PFGE-Analyse zeigte, dass skb1-F319Y wie skb1Δ die Isochromosomen, jedoch nicht die Chromosomenverkürzungen in rad51Δ-Zellen reduzierte (Abb. 2c, 6d und Tabelle 1). Wir untersuchten auch die Beziehung zwischen Skb1 und Rad52 und stellten fest, dass skb1Δ die GCR-Raten in rad52-R45K- oder rad52-R45K-rad51Δ-Zellen nicht signifikant senkte (Abb. 6e). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass Skb1 über seine RMTase-Aktivität die Rad52-abhängige Isochromosomenbildung fördert.

GCRs entstehen unter Verwendung repetitiver Sequenzen, die im Eukaryoten-Genom vorhanden sind. Der Mechanismus wiederholt vermittelter GCRs ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier fanden wir heraus, dass die evolutionär konservierten Srr1 und Skb1 die Isochromosomenbildung durch invertierte DNA-Wiederholungen am Zentromer fördern. Bemerkenswerterweise erhöhte srr1 die DNA-Schadensempfindlichkeit in rad51Δ-Zellen, hob jedoch nicht die Checkpoint-Reaktion auf, was darauf hindeutet, dass Srr1 die Rad51-unabhängige DNA-Reparatur fördert, die für GCRs anfällig ist. Die Mutationen srr1 und rad52 addierten sich, während skb1 und rad52 die GCR-Raten epistatisch reduzierten. Im Gegensatz zu srr1-Mutationen erhöhte skb1Δ die Empfindlichkeit gegenüber DNA-Schäden nicht und verringerte den Chromosomenverlust in rad51Δ-Zellen. Durch RMTase-Aktivität könnte Skb1 DNA-Strukturen bilden, die zu Rad52-abhängigen GCRs führen.

Srr1 und Skb1 fördern die Isochromosomenbildung am Zentromer. Wir fanden die Mutationen srr1-W157R und skb1-A377V in demselben Klon, der verringerte GCR-Werte aufweist (Abb. 1c). Entweder die Deletion von srr1 oder skb1 verringerte die GCR-Raten in rad51Δ-Zellen (Abb. 1d), was darauf hinweist, dass sowohl Srr1 als auch Skb1 GCRs fördern. Srr1 scheint für GCRs integraler zu sein als Skb1, da srr1Δ, aber nicht skb1Δ die GCR-Raten selbst in Gegenwart von Rad51 reduzierte (Abb. 1d). Die physikalische Analyse der GCR-Produkte zeigte, dass Srr1 und Skb1 für etwa 90 % der in rad51Δ-Zellen produzierten Isochromosomen verantwortlich sind, für Chromosomenkürzungen jedoch entbehrlich sind (Abb. 2c). Angesichts der Tatsache, dass Bruchpunkte der Isochromosomen in der Zentromerwiederholung vorhanden sind, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Srr1 und Skb1 durch Wiederholungen vermittelte GCRs am Zentromer fördern. Ob Srr1 oder Skb1 GCRs außerhalb des Zentromers verursachen, muss noch geklärt werden. Die srr1- und skb1-Mutationen reduzierten zusätzlich die GCR-Raten in rad51Δ-Zellen (Abb. 1d, e), was darauf hindeutet, dass Srr1 und Skb1 in GCRs keine überlappenden Rollen spielen (siehe unten).

Wie fördert Srr1 die Isochromosomenbildung? Wir schlagen vor, dass Srr1 die Reparatur von DNA-Schäden fördert, die für GCRs anfällig sind. Im Wildtyp repariert Rad51 hauptsächlich schädliche DNA-Schäden, wie etwa DNA-Doppelstrangbrüche, und schützt die Chromosomenintegrität. In Abwesenheit von Rad51 werden jedoch unreparierte DNA-Schäden in andere Reparaturwege geleitet, beispielsweise in den Rad52-abhängigen Rekombinationsweg29,30. Srr1 ist an der Rad51-unabhängigen DNA-Schadensreaktion beteiligt, da die Mutationen srr1 und rad51 zusätzlich die Empfindlichkeit gegenüber MMS, HU oder CPT erhöhten (Abb. 3a, 5e). Srr1 war für den MMS-induzierten Zellzyklusstopp und die Chk1-Phosphorylierung nicht essentiell (Abb. 3b, c), was darauf hindeutet, dass Srr1 eher die Reparatur von DNA-Schäden als die Checkpoint-Reaktion fördert. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass die Checkpoint-Kinasen Chk1 und Rad3 GCRs unterdrücken, aber nicht fördern20,58. Wie rad52Δ und rad52-R45K32 eliminierte srr1Δ etwa 90 % der Isochromosomen in rad51Δ-Zellen (Abb. 2c), was zeigt, dass Srr1 und Rad52 für den Hauptweg der Isochromosomenbildung essentiell sind. Allerdings können Srr1 und Rad52 auch nicht überlappende Rollen in GCRs spielen, da srr1- und rad52-Mutationen die GCR-Raten additiv reduzierten (Abb. 4a). Dies wird durch den additiven Effekt von srr1 und skb1 (Abb. 1d, e) und den epistatischen Effekt von skb1 und rad52 auf die GCR-Raten (Abb. 6e) gestützt. srr1Δ verursachte synthetische Wachstumsdefekte mit rad52Δ und akkumulierte spontane Herde von Rpa2 und Rad52 (Abb. 4b – e). srr1Δ verlängerte die Verdoppelungszeit und produzierte im Vergleich zum Wildtyp kleine Kolonien (Tabelle E in den Zusatzdaten 1; ergänzende Abbildung 2b). Srr1 kann die Reparatur spontaner DNA-Schäden fördern. Die Überempfindlichkeit von srr1-Zellen gegenüber DNA-schädigenden Wirkstoffen unterstützt dies, wir schließen jedoch die Möglichkeit nicht aus, dass Srr1 die Bildung spontaner DNA-Schäden unterdrückt. Obwohl ihre biochemische Funktion unbekannt bleibt, fanden wir, dass die SRR1-ähnliche Domäne entscheidend für GCRs und die Reparatur von DNA-Schäden ist. Die srr1-D111A-, P112A- und srr1-H148A-Mutationen, die evolutionär konservierte Reste in der SRR1-ähnlichen Domäne verändern, reduzierten die GCR-Raten stark und erhöhten die Empfindlichkeit gegenüber DNA-schädigenden Wirkstoffen, die das Fortschreiten der Gabelung beeinträchtigen und schließlich DNA-Brüche erzeugen (Abb. 5). ). Die N-terminale Verlängerung von Srr1 wird in Lit. als intrinsisch ungeordnet vorhergesagt. 56 und enthält positiv geladene Reste in Spalthefe und anderen Organismen, einschließlich Menschen, was auf seine Rolle bei der Wechselwirkung mit anderen Molekülen schließen lässt. Interessanterweise legt der Vergleich der Proteinstruktur mithilfe des Dali-Servers59 nahe, dass die SRR1-ähnliche Domäne strukturelle Ähnlichkeit mit einer Reihe von Proteinen aufweist, einschließlich Methyltransferasen (Supplementary Data 2). Das Ausschalten des Srr1-Homologs SRRD in Mauszellen beeinträchtigt die DNA-Replikation37, was darauf hindeutet, dass Srr1 bei Säugetieren auch eine Rolle bei der Reparatur spontaner DNA-Schäden spielt, die während der DNA-Replikation entstehen. Bei Pflanzen und Säugetieren beeinflusst SRR1/SRRD die Transkription der Gene, die am zirkadianen Rhythmus beteiligt sind37,38,60, was die Möglichkeit erhöht, dass Srr1 GCRs und die Reaktion auf DNA-Schäden durch Transkriptionsregulation fördert. Interessanterweise verursacht die srr1/ber1-Mutation in der Keimhefe synthetische Wachstumsdefekte mit Mutationen in den Zentromerproteinen, einschließlich der zentromerspezifischen Histon-H3-Variante Cse4/CENP-A39. Obwohl Spalthefe-srr1Δ-Zellen im Gegensatz zu aufkeimenden Hefe-srr1Δ/ber1Δ-Zellen nicht übermäßig resistent gegenüber einem Mikrotubuli-destabilisierenden Arzneimittel waren, ist es dennoch möglich, dass Srr1 die Isochromosomenbildung durch Beeinflussung der Zentromerstruktur fördert. Srr1 wurde in Spalthefe sowohl im Zellkern als auch im Zytosol lokalisiert61, aber ob Srr1 im Zentromer lokalisiert ist, bleibt unbekannt. Zukünftige Arbeiten müssen sich damit befassen, wie Srr1 die Isochromosomenbildung und die Reaktion auf DNA-Schäden fördert.

Es wurde gezeigt, dass eine Mutation in der Fbh1-Helikase Wachstums- und Rekombinationsdefekte von rad52Δ-Zellen unterdrückt62, was die Möglichkeit erhöht, dass spontane fbh1-Mutationen in unseren rad52Δ-Stamm eingeführt wurden und GCRs beeinflussen. Allerdings haben wir zuvor keine fbh1-Mutationen in unserem rad52Δ rad51Δ-Stamm36 gezeigt, der zur Bestimmung der GCR-Raten verwendet wurde. Wir haben auch bestätigt, dass in allen in dieser Studie verwendeten rad52-Mutantenstämmen und dem srr1Δ rad51Δ-Stamm keine fbh1-Mutationen vorliegen (Ergänzungsdaten 3). Darüber hinaus hatte die fbh1-Deletion keinen signifikanten Einfluss auf die Isochromosomenbildung in rad51Δ-Zellen (ergänzende Abbildung 4).

Skb1 ist an vielen Signalwegen beteiligt. Unsere Daten zeigen jedoch, dass Skb1 die Isochromosomenbildung unabhängig von seiner durch Slf1 bzw. Pom1 vermittelten Rolle in der Zellmorphologie und Zellzyklusregulation fördert (Abb. 6a). Skb1 und Slf1 binden sich gegenseitig und sind für ihre Lokalisierung in kortikalen Zellknoten 40 gegenseitig erforderlich. Die Lokalisierung des kortikalen Knotens ist für Skb1 nicht unbedingt erforderlich, um die Isochromosomenbildung zu fördern, da slf1Δ die GCR-Raten nicht verringerte. In rad51Δ-Zellen reduziert rad52-R45K die Isochromosomenbildung und erhöht die Empfindlichkeit für DNA-Schäden32. Die pcn1-K107R-Mutation in einer DNA-Schiebeklemme PCNA und rad52-R45K reduzieren epistatisch die Isochromosomenbildung, pcn1-K107R erhöht jedoch nicht die DNA-Schadensempfindlichkeit36. Wie pcn1-K107R beeinträchtigt skb1Δ die Rad52-abhängige Isochromosomenbildung (Abb. 6e), erhöht jedoch nicht die Empfindlichkeit für DNA-Schäden (Abb. 3a). Zusammen mit PCNA könnte Skb1 DNA-Strukturen bilden, die zu Rad52-abhängigen GCRs führen. rad51Δ-Zellen zeigten einen erhöhten Chromosomenverlust und GCRs, wahrscheinlich aufgrund der Unfähigkeit, spontane DNA-Schäden zu reparieren. Wie im Fall von GCRs (Abb. 1d) reduziert skb1Δ den Chromosomenverlust in rad51Δ-Zellen, jedoch nicht in Wildtyp-Zellen (Abb. 3e), was zeigt, dass Skb1 GCRs und Chromosomenverlust in rad51Δ-Zellen verursacht. Skb1 ist das Spalthefe-Homolog der PRMT5-Arginin-Methyltransferase (RMTase)44,63. PRMT5 wird in vielen bösartigen Tumoren, einschließlich Brustkrebs, überexprimiert und spielt eine Rolle bei der Entstehung von Krebs64. Interessanterweise wurden die Proteine, die die Chromatinstruktur und -replikation beeinflussen, wie Histone, Fen1-DNA-Flap-Endonuklease und p53, als PRMT5-Substrate gefunden65,66,67,68. Skb1 interagiert auch mit Shk1, einer p21-aktivierten Kinase (PAK), die den Zellzyklusverlauf negativ reguliert69. Die Mutation der für die RMTase-Aktivität essentiellen Reste:57 skb1-F319Y und skb1-E422A,E431A reduzierte die GCR-Raten stark, was darauf hindeutet, dass Skb1 GCRs durch die RMTase-Aktivität fördert. Es ist von entscheidender Bedeutung, das/die Schlüsselsubstrat(e) der Skb1-RMTase zu identifizieren, die in Zukunft eine Chromosomeninstabilität induzieren. Dennoch ebneten unsere Ergebnisse einen neuen Weg zur Aufklärung des Mechanismus von GCRs am Zentromer.

Die in dieser Studie verwendeten Spalthefestämme sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt und auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die in dieser Studie verwendeten DNA-Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die Zellen wurden in Hefeextraktmedium (YE) oder Edinburgh Minimal Medium 2 (EMM)70 bei 30 ° C gezüchtet, sofern nicht anders angegeben. Aminosäuren oder Basen wurden in einer Endkonzentration von 225 mg L−1 zugesetzt. Hefe-Stickstoff-Base-Medium (YNB) enthielt 7 g L-1 Hefe-Stickstoff-Base (BD Difco, BD 291940) und 20 g L-1 Glucose. YNB-Medium wird mit 1 g L-1 5-Fluororotsäure (Apollo Scientific, PC4054) und 56 mg L-1 Uracil (Nacalai Tesque, 35824–82) ergänzt, um 5-FOA-Medien herzustellen. Feste Medien enthielten 1,5 % Agarose (Nacalai Tesque, 01028–85). Die Hefetransformation wurde mit der Lithiumacetat/PEG-Methode71 durchgeführt. Hefezellen wurden in YE- oder YE3S-Medium bis zur logarithmischen Phase gezüchtet (1–2 × 107 Zellen ml–1) und durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden einmal mit sterilisiertem Wasser und zweimal mit 1 ml LiAc/TE-Puffer (0,1 M Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) gewaschen. Die Zellen wurden in LiAc/TE-Puffer bei > 2 × 109 Zellen ml−1 suspendiert. 100 μl der Zellsuspension wurden mit 5 μl Lachssperma-DNA (10 mg mL-1) und der einführenden DNA gemischt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 260 μl PEG/LiAc/TE (40 % PEG4000, 0,1 M Lithiumacetat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA) wurde das Röhrchen weitere 30 Minuten lang unter Rotation inkubiert. Nach Zugabe von 43 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde das Röhrchen 5 Minuten lang bei 42 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch 30-sekündige Zentrifugation bei 503 × g geerntet, in YE- oder YE3S-Medien suspendiert und auf nicht selektiven Medien ausplattiert. Nach einem Tag Inkubation wurden die Zellen auf einem Medium, das mit G418 (Nacalai Tesque, 09380–86) oder Hygromycin B (Nacalai Tesque, 09287–87) in einer Endkonzentration von 100 µg mL−1 oder clonNAT (Werner) ergänzt war, replikaplattiert BioAgents, 5.001.000) bei 50 µg mL−1 zur Auswahl der Transformanten. Wir haben keine außergewöhnlich großen Kolonien von rad52-Mutanten gefunden, da diese eine fbh1-Mutation62 enthalten können.

Um nach den Genen zu suchen, die GCRs in rad51Δ-Zellen verursachen, haben wir im Wesentlichen zufällige Mutationen in Hefe eingeführt, wie zuvor in Lit. beschrieben. 32. Salpetrige Säure wurde als Mutagen verwendet, da sie effizient Mutationen in Zellen mit DNA-Reparaturmangel einführt, wie z. B. in Wildtyp-Zellen72. In EMM gezüchtete rad51Δ-Zellen mit ChLC (TNF5411) wurden in der logarithmischen Phase gesammelt (5 × 106 Zellen ml−1), in Wasser suspendiert und über Nacht bei 4 °C aufbewahrt. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in 0,8 ml einer 0,01 M salpetrigen Säurelösung suspendiert, die vor der Verwendung durch Auflösen von Natriumnitrat (Wako, 195–20562) in 0,5 M Natriumacetat (pH 4,8) hergestellt wurde, und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe eines gleichen Volumens des Stopppuffers (3,6 % Na2HPO4·12H20 und 1 % Hefeextrakt) zur Zellsuspension wurden die Zellen auf EMM+UA-Platten ausplattiert. Die mithilfe von EMM-Platten bestimmte Ausplattierungseffizienz der mutagenisierten Zellen betrug etwa 10 %. 24.000 unabhängige Klone wurden als Patches auf EMM+UA-Platten für 2–3 Tage bei 30 °C inkubiert und dann auf 5-FOA+UA-Platten übertragen, um semiquantitativ die Rate der Uracil-Auxotrophie zu bestimmen, die aus GCR oder einer Punktmutation in resultiert das ura4-Gen. 80 Klone produzierten eine reduzierte Anzahl an Kolonien auf 5-FOA+UA-Platten. Die PFGE-Analyse zeigte, dass sechs die abweichenden Größen des ChLC der Eltern aufwiesen. Die verbleibenden 74 Klone wurden mit ChLC-haltigen Wildtyp-Zellen gekreuzt. Drei Klone zeigten reproduzierbar verringerte GCR-Raten. Eine Tiefensequenzierung genomischer DNA wurde mit MiSeq (Illumina, San Diego, CA) durchgeführt und die Mutationen wurden durch Pooled-Linkage-Analyse identifiziert73,74. Nukleotidsequenzdaten des Elternstamms und eines Pools von neun mutierten Segreganten, die durch Rückkreuzung eines der drei Klone erhalten wurden, sind im DDBJ Sequenced Read Archive unter den Zugangsnummern DRX042095 bzw. DRX042098 verfügbar.

Der Stamm srr1::kanMX6 wurde durch zwei Runden der Polymerase-Kettenreaktion, PCR75, erzeugt. Die Primer srr1-kan3 und srr1-kan5 wurden so entworfen, dass die 3'-Seite komplementär zu srr1 und die 5'-Seite komplementär zum kanMX6-Gen auf dem pFA6a-kanMX6-Plasmid76 war. In der ersten PCR-Runde wurden die srr1-flankierenden Regionen von 0,5 kb unter Verwendung der Primerpaare srr1-kan3/srr1-3 oder srr1-kan5/srr1-1 und genomischer Spalthefe-DNA als Matrize amplifiziert. Die zweite PCR-Runde wurde in Gegenwart der beiden PCR-Fragmente pFA6a-kanMX6 und srr1-1/srr1-3-Primer durchgeführt, um das DNA-Fragment zu erzeugen, das das srr1::kanMX6-Konstrukt enthält. Das 2,5 kb große PCR-Fragment wurde in Hefe eingeführt.

Der Stamm skb1::kanMX6 (oder skb1::hphMX6) wurde auf ähnliche Weise wie oben beschrieben erstellt. In der ersten PCR-Runde wurden skb1-flankierende Regionen von jeweils 0,5 kb unter Verwendung der Primerpaare skb1-1/skb1-kan5 oder skb1-kan3/skb1-2 amplifiziert. Die zweite PCR-Runde wurde in Gegenwart der beiden PCR-Fragmente pFA6a-kanMX6 (oder pFA6a-hphMX6) und skb1-1/skb1-2-Primer durchgeführt, um das DNA-Fragment zu erzeugen, das skb1::kanMX6 oder skb1 enthält ::hphMX6-Konstrukt. Das 2,5 oder 2,7 kb große PCR-Fragment wurde in Hefe eingeführt.

Um den Mutantenstamm srr1-W157R zu erzeugen, wurde das ura4+-Gen in das srr1-Gen in ura4-D18-Zellen eingeführt, wodurch ura4+:srr1-Zellen entstanden. In der ersten PCR-Runde wurden 0,5-kb-Regionen unter Verwendung der Primerpaare srr1-F1/srr1-ura4AN5 und srr1-ura4AN3/srr1-R1 amplifiziert. Die zweite PCR-Runde wurde in Gegenwart der beiden PCR-Fragmente, eines Plasmids, das das genomische Fragment ura4+ enthielt, und der Primer srr1-F1/srr1-R1 durchgeführt. Das 3-kb-PCR-Fragment wurde in Hefezellen transformiert und die ura4+-Transformanten wurden auf EMM-Medium selektiert. Als nächstes wurde die genomische Region, die die srr1-W157R-Mutation enthielt, durch PCR unter Verwendung von srr1-1/srr1-R1-Primern amplifiziert und die aus der srr1-W157R-skb1-A377V-Mutante hergestellte Matrizen-DNA wurde im Screening isoliert. Das 1,5 kb große PCR-Produkt wurde in den Stamm ura4+:srr1 eingeführt und ura4–-Transformanten wurden auf 5-FOA-Platten selektiert. Die DNA-Sequenzierung bestätigte die Integration der srr1-W157R-Mutation und keine weiteren Mutationen. Nach der Konstruktion des Stamms ura4+:skb1 wurde der Stamm skb1-A377V auf die gleiche Weise erstellt, außer dass skb1-F1/skb1-2-Primer verwendet wurden.

Das mutierte Fragment srr1-H148A wurde ebenfalls in zwei PCR-Runden erstellt. Zunächst wurden 0,6- und 0,5-kb-Fragmente unter Verwendung der Primerpaare srr1-H148A-F/srr1-R1 bzw. srr1-H148A-R/srr1-F1 und genomischer Spalthefe-DNA als Matrize amplifiziert. Sowohl die Primer srr1-H148A-F als auch srr1-H148A-R enthalten die srr1-H148A-Mutation. Die beiden überlappenden PCR-Fragmente wurden in der zweiten PCR-Runde in Gegenwart von srr1-F1/srr1-R1-Primern verbunden. Das 1,1 kb große Produkt wurde in den Stamm ura4+:srr1 eingeführt und ura4–-Transformanten wurden auf 5-FOA-Platten selektiert. Der srr1-D111A,P112A-Mutant wurde auf ähnliche Weise erzeugt. In der ersten PCR-Runde wurden 0,7- und 0,5-kb-Fragmente unter Verwendung der Primerpaare srr1-DPAA-F/srr1-R1 bzw. srr1-DPAA-R/srr1-F1 amplifiziert. Die beiden PCR-Fragmente wurden in der zweiten PCR-Reaktion mit den Primern srr1-F1/srr1-R1 verbunden. Das 1,1 kb große Produkt wurde in den Stamm ura4+:srr1 eingeführt. skb1-F319Y- und skb1-E422A-, E431A-Mutanten wurden auf die gleiche Weise unter Verwendung der Primerpaare skb1-F1/skb1-F319Y-R und skb1-F319Y-F/skb1-R1 sowie skb1-F1/skb1-doubleE-R und erzeugt skb1-doubleE-F/skb1-R1-Primerpaare. Korrekte Integration der Punktmutationen, jedoch wurden durch Sanger-Sequenzierung keine zusätzlichen Mutationen bestätigt.

Die GCR-Raten wurden durch den Fluktuationstest bestimmt, wie zuvor in Lit. beschrieben. 36. Hefezellen wurden 6–8 Tage lang auf EMM+UA-Platten inkubiert. Einzelne Kolonien wurden zum Animpfen von 10 ml flüssigem EMM+UA-Medium verwendet. Nach 1–2 Tagen Inkubation wurden die Zellen auf 5-FOA+UA- und YNB+UA-Platten ausplattiert. Nach 5–9 Tagen Inkubation wurden die auf 5-FOA+UA und YNB+UA gebildeten Kolonien gezählt, um die Anzahl der Leu+ Ura–- bzw. Leu+-Zellen zu bestimmen. Etwa sechs Kolonien von jeder 5-FOA+UA-Platte wurden auf EMM+UA ausgestrichen, um die Koloniegröße zu untersuchen, und dann auf EMM+U-Platten übertragen, um die Adenin-Auxotrophie zu untersuchen. Die Anzahl der Leu+ Ura– Ade–-Zellen, die auf GCR hinweist, wurde durch Subtrahieren der Anzahl der Leu+ Ura– Ade+-Zellen von der Anzahl der Leu+ Ura–-Zellen ermittelt. Die GCR-Raten pro Zellteilung wurden wie in Lit. beschrieben bestimmt. 77. Als wir mit Hefekulturen begannen, sammelten wir zufällig Kolonien unterschiedlicher Größe. Wir haben sowohl große als auch kleine Kolonien auf 5-FOA+UA-Platten für PFGE-Analysen gewonnen, entsprechend dem Verhältnis ihres Auftretens.

Die Chromosomenverlustraten wurden durch den Fluktuationstest bestimmt, wie zuvor in Lit. beschrieben. 27. Eine einzelne Kolonie, die sich nach 3–4 Tagen Inkubation auf YE3S-Platten gebildet hatte, wurde in sterilisiertem Wasser suspendiert und die Zellen wurden auf YE-Platten ausplattiert. Nach 4–6 Tagen Inkubation wurden weiße und rote Kolonien gezählt. Die roten Kolonien, die auf einen Ade6-Verlust hinweisen, wurden auf YE3S- und EMM+UA-Platten übertragen, um die Leucin-Auxotrophie zu untersuchen. Auf YE3S-Platten gezüchtete Kolonien wurden auf EMM+UL- und EMM+AL-Platten replikaplattiert, um die Adenin- bzw. Uracil-Auxotrophie zu testen. Die Anzahl der Leu-Ura-Ade-Zellen, die einen ChLC-Chromosomenverlust anzeigen, und die Gesamtzahl der koloniebildenden Zellen wurden verwendet, um die Chromosomenverlustrate pro Zellteilung zu ermitteln77.

Jeder GCR-Klon wurde aus einer unabhängigen Kultur erhalten, um mehrere Klone vom gleichen Elternteil zu vermeiden. Die Zellen wurden 12–24 Stunden lang in YE3S-Medium bei 25 °C gezüchtet. 1 × 108 Zellen wurden geerntet, in 2,5 ml eiskaltem 50 mM EDTA suspendiert und bei 4 °C gelagert. Die Zellen wurden zentrifugiert und in 1 ml CSE-Puffer (20 mM Citratphosphat, 1 M Sorbit, 50 mM EDTA (pH 5,6)) resuspendiert. Zur Herstellung von Sphäroplasten wurden 5 μl Zymolyase 20 T (Seikagaku, Tokio, Japan, 25 mg mL-1) und 5 μl lysierendes Enzym (Sigma, St. Louis, Missouri, 25 mg mL-1) zur Zellsuspension gegeben und inkubiert bei 30 °C für 20 bis 50 Min. Spheroplasten wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 33 × g und 4 ° C geerntet und das Pellet in 140 μl CSE-Puffer suspendiert. Ein gleiches Volumen 1,6 %iges niedrigschmelzendes Agarosegel (Nacalai Tesque, 01161–12), vorgewärmt auf 50 °C, wurde der Zellsuspension zugesetzt und in Formen verteilt. Die Agarosepfropfen wurden 20 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die Plugs wurden in SDS-EDTA-Lösung (1 % SDS, 0,25 M EDTA) 2 Stunden lang bei 60 °C und dann in ESP-Lösung (0,5 M EDTA, 1 % N-Lauroylsarcosin, 1,5 mM Calciumacetat), ergänzt mit 0,5, inkubiert mg mL−1 Proteinase K (Nacalai Tesque, 39450–01–6) bei 50 °C über Nacht. Die Plugs wurden in eine andere ESP-Lösung, ergänzt mit 0,5 mg mL−1 Proteinase K, überführt und weitere 8 Stunden bei 50 °C inkubiert. Die Plugs wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) bei 4 °C gelagert. Chromosomale DNAs wurden unter Verwendung eines CHEF-DRII-Pulsfeldelektrophoresesystems (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien) aufgelöst. PFGE lief bei 4,2 V cm−1 mit einer Pulszeit von 40 bis 70 s für 24 Stunden bei 4 °C in 0,5× TBE-Puffer (89 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) unter Verwendung von 0,55 % zertifiziertem Megabase-Agarose-Gel. Die DNA wurde mit 0,2 µg mL-1 Ethidiumbromid (EtBr) (Nacalai Tesque, 14631–94) gefärbt und mit einem Typhoon FLA9000 Gel-Bildgebungsscanner (GE Healthcare, Chicago, Illinois) oder einem GelDoc Go-Bildgebungssystem (Bio-Rad, Hercules) nachgewiesen , CA). Gelbilder wurden mit ImageJ2 2.9.0 (NIH, USA) oder Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA) verarbeitet.

Eine einzelne Kolonie, die sich nach 3–4-tägiger Inkubation auf YE- (oder YE3S-)Platten bildete, wurde zum Beimpfen von 2 ml flüssigem YE- (oder YE3S-)Medium verwendet. Die 2-ml-Übernachtkultur wurde zur Herstellung von 10-ml-Log-Phasen-Kulturen verwendet. Fünffache Reihenverdünnungen der angegebenen Stämme wurden mit sterilisiertem Wasser hergestellt. 6 µL jeder Verdünnung wurden auf YE- (oder YE3S-)Platten getupft, ergänzt mit der angegebenen Konzentration an MMS, HU, CPT oder TBZ. Die Platten wurden 3–5 Tage lang bei 30 °C inkubiert. Die Bilder wurden mit GT-X800 (Epson, Nagano, Japan) aufgenommen und mit Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA) verarbeitet.

Zellextrakte wurden mithilfe einer alkalischen Lysemethode hergestellt78. 1 × 108 Zellen aus YE-Kulturen in der logarithmischen Phase wurden gesammelt, mit 1 ml H2O gewaschen und in 300 µl H2O suspendiert. Nach Zugabe von 300 µl 0,6 M NaOH wurde die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 30 °C unter rotierendem Röhrchen inkubiert. Nach 3-minütiger Zentrifugation bei 6000 U/min (TOMY, MX-201) wurden die mit Alkali behandelten Zellen mit 140 µ SDS-Probenpuffer (60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5 % Glycerin, 4 % Natriumdodecyl) suspendiert Sulfat, 4 % β-Mercaptoethanol, 0,005 % Bromphenolblau) und 3 Minuten bei 95 °C inkubiert. Zellextrakte wurden aus dem Überstand nach einminütiger Zentrifugation bei 15.000 U/min (TOMY, Kitman) gewonnen, durch 8 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Verhältnis Acrylamid zu Bisacrylamid 37,5:1) aufgetrennt und übertragen auf PolyScreen PVDF-Transfermembran (Perkin Elmer, NEF1002001PK). Zum Nachweis von Chk1-HA, einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen den HA-Tag (16B12, Abcam, Cambridge, MA) (1:2000) und Peroxidase AffiniPure Ziegen-Anti-Maus-IgG (schwer+leicht) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115–035−). 146) (1:10.000) wurden als primäre bzw. sekundäre Antikörper verwendet. Die Blots wurden mit Supersignal West Femto-Substrat (ThermoScientific, 34095) entwickelt. Die Bilder wurden mit ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare) aufgenommen.

MMS wurde den EMM-Kulturen in der logarithmischen Phase bis zu einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt. 0, 2, 4, 6 und 8 Stunden nach der Zugabe von MMS wurden die Zellen geerntet, in 70 % Ethanol suspendiert und bei 4 °C gelagert. Die Zellen wurden in PEMS-Puffer (100 mM PIPES (pH 6,9), 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 M Sorbitol) suspendiert, der 2 µg mL−1 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und 4 enthielt µg mL−1 Calcofluor. Die Zellsuspension wurde mit einem Eindeckmedium (90 % Glycerin, 1 mg mL-1 n-Propylgallat, 1 mg mL-1 1,4-Phenylendiamin-Dihydrochlorid, 0,1 × phosphatgepufferte Kochsalzlösung) auf einem mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas gemischt . Unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (BX51, Olympus, Tokio, Japan) mit einem 100-fachen Objektiv (NA = 1,40, Olympus, Tokio, Japan) wurden Kerne und Septen mit DAPI bzw. Calcofluor sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera (DP72, Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen und mit cellSens Standard 2.3 (Olympus) und Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA) verarbeitet.

Exponentiell wachsende Zellen in EMM- (Rpa2-mCherry) oder YE-Medium (Rad52-GFP) wurden gesammelt, auf Glasbodenschalen (Matsunami Glass, Osaka, Japan, D11130H) ausgesät und mit einem DeltaVision Personal-Fluoreszenzmikroskopiesystem (GE Healthcare) beobachtet ), das auf einem Olympus-Weitfeld-IX71-Fluoreszenzmikroskop basiert, das mit einer CoolSNAP HQ2 CCD-Kamera (Photometrics, Tucson, Arizona) und einem Ölimmersionsobjektiv (UAPO 40×; NA = 1,35; Olympus, Tokio, Japan) ausgestattet ist. . Der Prozentsatz der Kerne mit Rpa2-mCherry- und Rad52-GFP-Fokus wurde durch Zählen der Kerne, die mindestens einen Rpa2-mCherry- bzw. Rad52-GFP-Fokus enthielten, unter Verwendung von ImageJ2 2.9.0 (NIH, USA) ermittelt. In jedem Experiment wurden > 300 Kerne gezählt. Drei unabhängige experimentelle Werte und ihre Mittelwerte wurden in der Grafik mit GraphPad Prism 9 für MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA) dargestellt. Die Bilder wurden mit ImageJ2 2.9.0 oder Adobe Photoshop Elements 2020 verarbeitet.

Exponentiell wachsende Zellen der angegebenen Stämme wurden hergestellt und fünffach seriell mit sterilisiertem Wasser verdünnt. 6 µL jeder Verdünnung wurden auf YE-Platten, ergänzt mit DMSO oder 200 nM 5'a-IAA (Tokyo Chemical Industry, A3390)51, getupft. Die Platten wurden 2 Tage lang inkubiert. Die Bilder wurden mit GT-X800 (Epson, Nagano, Japan) aufgenommen und mit Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe, San Jose, CA) verarbeitet.

Der zweiseitige Mann-Whitney-Test und der zweiseitige Fischer-Test wurden mit GraphPad Prism 9 für MacOS durchgeführt. Der zweiseitige Student-T-Test und der Pearson-Chi-Quadrat-Test wurden mit Microsoft Excel für Mac 16.72 durchgeführt. Die zur Ableitung jeder Statistik verwendete Stichprobengröße wurde in der Legende der Abbildung oder in den Zusatzinformationen angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in der Veröffentlichung „Ergänzende Informationen“ (Ergänzende Abbildungen 1–6 und Ergänzende Tabellen 1–2) und „Ergänzende Daten 1–3“ enthalten. DNA-Sequenzdaten des Elternstamms und eines Pools der mutierten Segreganten sind im DDBJ Sequenced Read Archive unter den Zugangsnummern DRX042095 bzw. DRX042098 unter der folgenden URL verfügbar: https://ddbj.nig.ac.jp/resource /bioproject/PRJDB4206. Alle Rohdatensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

In diesem Artikel wurde die Legende zu Abbildung 1 falsch platziert, sodass sie einen Teil der Abbildung überlappte. Dies wurde nun korrigiert.

Pascarella, G. et al. Die Rekombination von Wiederholungselementen erzeugt somatische Komplexität im menschlichen Genom. Zelle 185, 3025–3040 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Carvalho, CM & Lupski, JR Mechanismen, die der Bildung struktureller Varianten bei genomischen Störungen zugrunde liegen. Nat. Rev. Genet. 17, 224–238 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nurk, S. et al. Die vollständige Sequenz eines menschlichen Genoms. Wissenschaft 376, 44–53 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koonin, EV Evolution der Genomarchitektur. Int J. Biochem Cell Biol. 41, 298–306 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Altemose, N. et al. Vollständige genomische und epigenetische Karten menschlicher Zentromere. Science 376, eabl4178 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Padilla-Nash, HM et al. Springende Translokationen kommen in soliden Tumorzelllinien häufig vor und führen zu wiederkehrenden Fusionen ganzer Chromosomenarme. Genes Chromosomes Cancer 30, 349–363 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martinez, AC & van Wely, KH Die Zentromerspaltung, nicht die Telomererosion, löst eine chromosomale Instabilität bei menschlichen Karzinomen aus. Carcinogenesis 32, 796–803 (2011).

Artikel Google Scholar

Rozenzhak, S. et al. Rad3 dekoriert kritische chromosomale Domänen mit γH2A, um die Genomintegrität während der S-Phase in Spalthefe zu schützen. PLoS Genet. 6, e1001032 (2010).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yilmaz, D. et al. Die Aktivierung der homologen Rekombination in G1 bewahrt die zentromere Integrität. Natur 600, 748–753 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Saayman, Mol. Zelle 83, 523–538 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Barra, V. & Fachinetti, D. Die dunkle Seite der Zentromere: Arten, Ursachen und Folgen struktureller Anomalien, die auf zentromere DNA zurückzuführen sind. Nat. Komm. 9, 4340 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakagawa, T. & Okita, AK Die transkriptionelle Stummschaltung von Zentromerwiederholungen durch Heterochromatin schützt die Chromosomenintegrität. Curr. Genet. 65, 1089–1098 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Black, EM & Giunta, S. Repetitive fragile Sites: Centromer-Satelliten-DNA als Quelle der Genominstabilität bei menschlichen Krankheiten. Genes (Basel) 9, 615 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Therman, E., Susman, B. & Denniston, C. Die nichtzufällige Beteiligung menschlicher akrozentrischer Chromosomen an Robertson-Translokationen. Ann. Summen. Genet. 53, 49–65 (1989).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tuna, M., Amos, CI & Mills, GB Die erworbene uniparentale Disomie des gesamten Chromosomenarms bei der Krebsentstehung ist eine Folge der Isochromosomenbildung. Neoplasia 25, 9–17 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huijsdens-van Amsterdam, K. et al. Isochromosom 21q ist unter den falsch-negativen pränatalen Screening-Ergebnissen zellfreier DNA mit Down-Syndrom überrepräsentiert. EUR. J. Hum. Genet 26, 1490–1496 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cechova, M. & Miga, KH Satelliten-DNAs und Variation der menschlichen Geschlechtschromosomen. Semin Cell Dev. Biol. Rev. 128, 15–25 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Allshire, RC & Ekwall, K. Epigenetische Regulierung von Chromatinzuständen. Schizosaccharomyces pombe. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. 7, a018770 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

McKinley, KL & Cheeseman, IM Die molekulare Basis für die Identität und Funktion von Zentromeren. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 17, 16–29 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, K. et al. Rad51 unterdrückt die grobe Chromosomenumlagerung im Zentromer. Schizosaccharomyces pombe. EMBO J. 27, 3036–3046 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tinline-Purvis, H. et al. Eine fehlgeschlagene Genumwandlung führt zu umfangreicher Endverarbeitung und chromosomalen Umlagerungen in der Spalthefe. EMBO J. 28, 3400–3412 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, PC et al. Die Stabilität der Replikationsgabel ist für die Aufrechterhaltung der Zentromerintegrität in Abwesenheit von Heterochromatin von entscheidender Bedeutung. Cell Rep. 3, 638–645 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ranjha, L., Howard, SM & Cejka, P. Hauptschritte bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen: Eine Einführung in die homologe Rekombination und verwandte Prozesse. Chromosoma 127, 187–214 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nalepa, G. & Clapp, DW Fanconi-Anämie und Krebs: eine komplizierte Beziehung. Nat. Rev. Cancer 18, 168–185 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nielsen, FC, van Overeem Hansen, T. & Sorensen, CS Erblicher Brust- und Eierstockkrebs: neue Gene auf begrenzten Wegen. Nat. Rev. Cancer 16, 599–612 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wassing, IE et al. Die RAD51-Rekombinase schützt das mitotische Chromatin in menschlichen Zellen. Nat. Komm. 12, 5380 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Onaka, AT et al. Rad51 und Rad54 fördern die Non-Crossover-Rekombination zwischen Zentromer-Wiederholungen auf demselben Chromatid, um die Bildung von Isochromosomen zu verhindern. Nukleinsäuren Res. 44, 10744–10757 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zafar, F. et al. Regulierung der mitotischen Rekombination zwischen DNA-Wiederholungen in Zentromeren. Nukleinsäuren Res. 45, 11222–11235 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rossi, MJ, DiDomenico, SF, Patel, M. & Mazin, AV RAD52: Paradigma der synthetischen Letalität und neue Entwicklungen. Vorderseite. Genet. 12, 780293 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jalan, M., Olsen, KS & Powell, SN Neue Rollen von RAD52 bei der Genompflege. Krebserkrankungen (Basel) 11, 1038 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kowalczykowski, SC Ein Überblick über die molekularen Mechanismen der rekombinatorischen DNA-Reparatur. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Biol. 7, a016410 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Onaka, AT et al. Die DNA-Replikationsmaschinerie verhindert Rad52-abhängiges Einzelstrang-Annealing, das zu groben chromosomalen Umlagerungen an Zentromeren führt. Komm. Biol. 3, 202 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boddy, MN et al. Mus81-Eme1 sind wesentliche Bestandteile einer Holliday-Junction-Resolvase. Zelle 107, 537–548 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Osman, F., Dixon, J., Doe, CL & Whitby, MC Generierung von Crossovers durch Auflösung geknickter Holliday-Junctions: eine Rolle für Mus81-Eme1 bei der Meiose. Mol. Zelle 12, 761–774 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smith, GR, Boddy, MN, Shanahan, P. & Russell, P. Die Spalthefe Mus81.Eme1 Holliday Junction Resolvase ist für das meiotische Crossover, aber nicht für die Genumwandlung erforderlich. Genetics 165, 2289–2293 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Su, J., PLoS Genet 17, e1009671 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adachi, Y. et al. Das neuartige Häm-abhängige induzierbare Protein SRRD reguliert die Häm-Biosynthese und den zirkadianen Rhythmus. Bogen. Biochem Biophys. 631, 19–29 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Staiger, D. et al. Das SRR1-Gen von Arabidopsis vermittelt die phyB-Signalübertragung und ist für die normale Funktion der zirkadianen Uhr erforderlich. Genes Dev. 17, 256–268 (2003).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fiechter, V. et al. Das evolutionär konservierte BER1-Gen ist an der Mikrotubuli-Stabilität in Hefe beteiligt. Curr. Genet. 53, 107–115 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deng, L., Kabeche, R., Wang, N., Wu, JQ & Moseley, JB Megadalton-Knoten-Zusammenbau durch Bindung von Skb1 an den Membrananker Slf1. Mol. Biol. Zelle 25, 2660–2668 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Miller, KE, Magliozzi, JO, Picard, NA & Moseley, JB Die Sequestrierung des exozytischen SNARE Psy1 in Multiproteinknoten verstärkt die polarisierte Morphogenese in Spalthefe. Mol. Biol. Zelle 32, AR7 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, SG & Berthelot-Grosjean, M. Polargradienten der Kinase Pom1 der DYRK-Familie koppeln die Zelllänge mit dem Zellzyklus. Natur 459, 852–856 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deng, L. & Moseley, JB Kompartimentierte Knoten steuern die mitotische Eintrittssignalisierung in Spalthefe. Mol. Biol. Zelle 24, 1872–1881 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, J. & Richard, S. Zellwege, die durch die Protein-Arginin-Methylierung beeinflusst werden: Auswirkungen auf Krebs. Mol. Zelle 81, 4357–4368 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pollack, BP et al. Das menschliche Homolog der Hefeproteine ​​Skb1 und Hsl7p interagiert mit Jak-Kinasen und enthält Protein-Methyltransferase-Aktivität. J. Biol. Chem. 274, 31531–31542 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Niwa, O., Matsumoto, T. & Yanagida, M. Konstruktion eines Mini-Chromosoms durch Deletion und sein mitotisches und meiotisches Verhalten in Spalthefe. Mol. Gen. Genet 203, 397–405 (1986).

Artikel CAS Google Scholar

Walworth, N., Davey, S. & Beach, D. Die Spalthefe-Chk1-Proteinkinase verbindet den Rad-Checkpoint-Weg mit cdc2. Nature 363, 368–371 (1993).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lopez-Girona, A. et al. Serin-345 ist für die Rad3-abhängige Phosphorylierung und Funktion der Checkpoint-Kinase Chk1 in Spalthefe erforderlich. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA. 98, 11289–11294 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Capasso, H. et al. Phosphorylierung aktiviert Chk1 und ist für den Checkpoint-vermittelten Zellzyklusstopp erforderlich. J. Cell Sci. 115, 4555–4564 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chaudhuri, B., Ingavale, S. & Bachhawat, AK apd1+, ein Gen, das für die Bildung roter Pigmente in ade6-Mutanten von Schizosaccharomyces pombe erforderlich ist, kodiert ein Enzym, das für die Glutathion-Biosynthese erforderlich ist: Eine Rolle für Glutathion und eine Glutathion-Konjugat-Pumpe. Genetics 145, 75–83 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watson, AT, Hassell-Hart, S., Spencer, J. & Carr, AM Reis (Oryza sativa) TIR1 und 5'Adamantyl-IAA verbessern das Auxin-induzierbare Degron-System erheblich. Schizosaccharomyces pombe. Genes (Basel) 12, 882 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, R. & Wold, MS Replikationsprotein A: Der Ersthelfer einzelsträngiger DNA: Dynamische DNA-Wechselwirkungen ermöglichen es Replikationsprotein A, einzelsträngige DNA-Zwischenprodukte in verschiedene Wege zur Synthese oder Reparatur zu leiten. Bioessays 36, 1156–1161 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oshidari, R. et al. DNA-Reparatur durch Rad52-Flüssigkeitströpfchen. Nat. Komm. 11, 695 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varadi, M. et al. AlphaFold-Proteinstrukturdatenbank: Massive Erweiterung der strukturellen Abdeckung des Proteinsequenzraums mit hochpräzisen Modellen. Nukleinsäuren Res. 50, D439–D444 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hu, G. et al. flDPnn: Genaue intrinsische Störungsvorhersage mit mutmaßlichen Neigungen von Störungsfunktionen. Nat. Komm. 12, 4438 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, L. et al. Strukturelle Einblicke in die symmetrische Dimethylierung von Protein Arginin durch PRMT5. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 108, 20538–20543 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blaikley, EJ et al. Der DNA-Schadens-Checkpoint-Weg fördert eine umfassende Resektion und Nukleotidsynthese, um die Reparatur homologer Rekombination und die Genomstabilität in Spalthefe zu erleichtern. Nukleinsäuren Res. 42, 5644–5656 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holm, L. Dali Server: Strukturelle Vereinheitlichung von Proteinfamilien. Nukleinsäuren Res. 50, W210–W215 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johansson, M. & Staiger, D. SRR1 ist wichtig, um die Blüte unter nicht-induktiven Bedingungen bei Arabidopsis thaliana zu unterdrücken. J. Exp. Bot. 65, 5811–5822 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsuyama, A. et al. ORFeome-Klonierung und globale Analyse der Proteinlokalisierung in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe. Nat. Biotechnologie. 24, 841–847 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Osman, F., Dixon, J., Barr, AR & Whitby, MC Die F-Box-DNA-Helikase Fbh1 verhindert die Rhp51-abhängige Rekombination ohne Mediatorproteine. Mol. Zellbiol. 25, 8084–8096 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Branscombe, TL et al. PRMT5 (Janus-Kinase-bindendes Protein 1) katalysiert die Bildung symmetrischer Dimethylargininreste in Proteinen. J. Biol. Chem. 276, 32971–32976 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xiao, W. et al. Rolle des Proteins Arginin-Methyltransferase 5 bei Krebserkrankungen beim Menschen. Biomed. Pharmakotherapeut. 114, 108790 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhao, Q. et al. PRMT5-vermittelte Methylierung von Histon H4R3 rekrutiert DNMT3A und koppelt Histon- und DNA-Methylierung bei der Gen-Stummschaltung. Nat. Struktur. Mol. Biol. 16, 304–311 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, F. et al. PRMT5-vermittelte Histon-Arginin-Methylierung antagonisiert die Transkriptionsrepression durch den Polycomb-Komplex PRC2. Nukleinsäuren Res. 48, 2956–2968 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guo, Z. et al. Die Methylierung von FEN1 unterdrückt die Phosphorylierung in der Nähe und erleichtert die PCNA-Bindung. Nat. Chem. Biol. 6, 766–773 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berger, SL Aus dem Rachen des Todes: PRMT5 steuert S. 53. Nat. Zellbiol. 10, 1389–1390 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilbreth, M. et al. Negative Regulierung der Mitose in Spalthefe durch das Shk1-interagierende Protein Skb1 und sein menschliches Homolog Skb1Hs. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 95, 14781–14786 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Forsburg, SL & Rhind, N. Grundlegende Methoden für Spalthefe. Yeast 23, 173–183 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sabatinos, SA & Forsburg, SL Molekulargenetik von Schizosaccharomyces pombe. Methoden Enzymol. 470, 759–795 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Prakash, L. Fehlen einer chemisch induzierten Mutation in reparaturdefizienten Hefemutanten. Genetics 78, 1101–1118 (1974).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Birkeland, SR et al. Entdeckung von Mutationen in Saccharomyces cerevisiae durch gepoolte Verknüpfungsanalyse und Gesamtgenomsequenzierung. Genetics 186, 1127–1137 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iida, N., Yamao, F., Nakamura, Y. & Iida, T. Mudi, ein Web-Tool zur Identifizierung von Mutationen durch bioinformatische Analyse der gesamten Genomsequenz. Genes Cells 19, 517–527 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Petracek, ME & Longtine, MS PCR-basiertes Engineering des Hefegenoms. Methoden Enzymol. 350, 445–469 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hentges, P., Van Driessche, B., Tafforeau, L., Vandenhaute, J. & Carr, AM Drei neuartige Antibiotika-Markerkassetten für Genunterbrechung und Markerwechsel. Schizosaccharomyces pombe. Yeast 22, 1013–1019 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, M., Chang, CJ & Green, NS Eine neue Methode zur Abschätzung hoher Mutationsraten in kultivierten Zellen. Mutat. Res. 351, 105–116 (1996).

Artikel PubMed Google Scholar

Matsuo, Y., Asakawa, K., Toda, T. & Katayama, S. Eine schnelle Methode zur Proteinextraktion aus Spalthefe. Biowissenschaften. Biotechnologie. Biochem 70, 1992–1994 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Wir danken Akiko Okita, Jie Su und Yukiko Kubota für ihre kritischen Kommentare zum Manuskript und Hirofumi Ohmori und Keiko Kayahara für ihre technische Unterstützung. Wir danken außerdem Adam T. Watson und Antony M. Carr für die Bereitstellung des AID2-Systems. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Grant Numbers 221S0002, JP23570212, JP26114711, 18K06060, 21H02402 und der Uehara Memorial Foundation Grant Number 202120462 an TN unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan.

Abteilung für Biowissenschaften, Graduate School of Science, Universität Osaka, 1−1 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japan

Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita, Keitaro Oki und Takuro Nakagawa

Forefront Research Center, Graduate School of Science, Universität Osaka, 1−1 Machikaneyama, Toyonaka, Osaka, 560-0043, Japan

Piyusha Mongia, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita und Takuro Nakagawa

Forschungszentrum für medizinische Mykologie, Universität Chiba, Chiba, 260-8673, Japan

Hiroki Takahashi

Abteilung für Mikrobiologie, Abteilung für Infektionsmedizin, Kurume University School of Medicine, Kurume, Fukuoka, 830-0011, Japan

Yoshitoshi Ogura

Abteilung für Bakteriologie, Fakultät für Medizinische Wissenschaften, Kyushu-Universität, Fukuoka, 812-8582, Japan

Tetsuya Hayashi

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PM, NT und TN konzipierten die Studie. PM, NT und ZP führten die meisten Experimente mit technischer Hilfe von RX, YK, KO und TN durch. Die Tiefensequenzierung wurde von HT, YO und TH durchgeführt. Das Manuskript wurde von TN und PM verfasst und von allen Autoren genehmigt.

Korrespondenz mit Takuro Nakagawa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Gerben Vader und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Manuel Breuer. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mongia, P., Toyofuku, N., Pan, Z. et al. Spalthefe Srr1 und Skb1 fördern die Isochromosomenbildung am Zentromer. Commun Biol 6, 551 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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Eingegangen: 14. Oktober 2022

Angenommen: 09. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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