Modulation der Proliferation und Apoptose von Darmepithelzellen durch Lactobacillus gasseri SF1183

Apr 05, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 20248 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Darmmikrobiota übt eine Vielzahl positiver Auswirkungen auf die Darmhomöostase aus, darunter die Produktion nützlicher Moleküle, die Kontrolle der Integrität der Epithelbarriere und die Regulierung des Gleichgewichts zwischen Zelltod und -proliferation des Wirts. Die Wechselwirkungen zwischen Kommensalbakterien und Darmzellen sind immer noch unzureichend erforscht und daher ist es von größter Bedeutung, solche Wechselwirkungen auf molekularer und zellulärer Ebene zu untersuchen. Wir berichten über eine In-vitro-Analyse der Wirkungen von Molekülen, die von Lactobacillus gasseri SF1183 sezerniert werden, auf HCT116-Zellen, die als Modell für Darmepithelzellen ausgewählt wurden. SF1183 ist ein L. gasseri-Stamm, der aus einer Ileumbiopsie eines gesunden Freiwilligen isoliert wurde und in der Lage ist, Kolitissymptome in vivo zu verhindern. Wir erweitern frühere Erkenntnisse und zeigen, dass von SF1183 sezernierte bioaktive Moleküle die Proliferation von HCT116-Zellen auf reversible Weise reduzieren, was zu einer Variation der Zellzyklusmarker (p21WAF, p53, Cyclin D1) führt und zum Schutz von HCT116-Zellen vor TNF-alpha führt Apoptose, ein Effekt, der möglicherweise für den Schutz der Integrität der Epithelbarriere und die Wiederherstellung der Gewebehomöostase relevant ist. Konsistent erhöhen SF1183-sekretierte Moleküle die Rekrutierung von Occludin, einem Hauptbestandteil von TJ, an den Zell-Zell-Kontakten, was auf eine Verstärkung der Barrierefunktion schließen lässt.

Die Darmmikrobiota entwickelte sich gemeinsam mit ihrem tierischen Wirt, ging eine symbiotische Beziehung ein und trug zur Stoffwechselgesundheit des Wirts bei. Die relative Verteilung der Darmbakterien ist individuell individuell und ändert sich vorübergehend je nach Ernährung, Alter, Körperübungen, Drogenkonsum und Wirtsgenetik, was es schwierig macht, eine normale oder gesunde Mikrobiota zu definieren. Eine hohe Taxa-Diversität, ein hoher Artenreichtum und stabile Mikrobiota-Funktionskerne zeichnen jedoch gesunde mikrobielle Gemeinschaften im Darm aus1. Drastische Veränderungen dieser mikrobiellen Zusammensetzung (Dysbiose) werden mit der Pathogenese verschiedener Stoffwechselstörungen und entzündlicher Darmerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter auch Dickdarmentzündungen (UC, Colitis ulcerosa, Zöliakie, Morbus Chron), allgemein als entzündliche Darmerkrankungen (IBD) bezeichnet. IBDs sind durch eine abnormale Produktion entzündlicher Zytokine (TNF-α, Tumornekrosefaktor Alpha, IFN-γ Interferon Gamma) durch Wirtszellen und eine Störung der Epithelintegrität, teilweise aufgrund einer verstärkten Apoptose, gekennzeichnet. Um diese Bedingungen auszugleichen, wurde eine Reihe mikrobiotagesteuerter Interventionsstrategien vorgeschlagen und in Tiermodellen und in einigen Fällen in Versuchen am Menschen getestet. Dazu gehört die orale Verabreichung von (1) Präbiotika, unverdaulichen Oligosacchariden (z. B. Inulin und Oligofruktose), die, sobald sie von einigen Mitgliedern der Mikrobiota fermentiert werden, eine Verbesserung der Darmbarrierefunktionen bewirken, und (2) Probiotika, lebenden Bakterien, die sich ansiedeln Der Darm hat eine positive Wirkung auf die Gesundheit (3) Synbiotika, eine Kombination aus Präbiotika und verschiedenen probiotischen Stämmen; und (4) Postbiotika, pasteurisierte Probiotika oder Teile mikrobieller Stämme1.

Die orale Anwendung von Probiotika wird derzeit sehr gut akzeptiert, da einige Bakterien die Fähigkeit haben, die Zytokinexpression zu beeinflussen, Entzündungen zu reduzieren und die Integrität der Darmbarriere zu schützen2,3,4,5,6. Die Verwendung von Probiotika hat ihren Ursprung in traditionellen Lebensmitteln, die lebende Bakterien enthalten, die in vielen Kulturen verbreitet sind und denen eine gesundheitsfördernde Wirkung zugeschrieben wird. Bekannte Beispiele in diesem Zusammenhang sind Milchsäurebakterien, die in einer Vielzahl traditioneller fermentierter Lebensmittel vorkommen7, und Sporenbildner der Gattung Bacillus, die in Natto vorkommen, einem traditionellen japanischen gesunden Lebensmittel auf der Basis von Sojabohnen, die mit B. subtilis var. fermentiert wurden. Natto und in ähnlichen fermentierten Lebensmitteln, die traditionell in verschiedenen Ländern verwendet werden8. Mehrere Arten der Gattungen Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus und Saccharomyces werden seit langem als kommerzielle Probiotika verwendet8,9. Darüber hinaus wurden andere Darmbakterien als Probiotika der nächsten Generation vorgeschlagen, beispielsweise Faecalibacterium prausnitzii10 und Akkermansia muciniphila11.

Die molekularen Mechanismen, die die Interaktion zwischen Darmzellen und Bakterien steuern, wurden teilweise in vitro untersucht. Beispiele sind L. casei Shirota, das immunmodulatorische Wirkungen hat, indem es die Produktion von Interleukin-12 (IL-12) induziert; L. fermentum NCIMB 5221, das eine antiproliferative Wirkung hat und Hyperinsulinämie, Insulinresistenz, Hypercholesterinämie und Hypertriglyceridämie moduliert; Saccharomyces cerevisiae var.boulardii, das entzündungshemmende und antibakterielle Wirkungen hat, indem es die Sekretion von Immunglobulin A (IgA) erhöht und die Integrität der Epithelbarriere aufrechterhält12. Es wurde häufig gezeigt, dass Quorum-Sensing-Autoinduktoren, Kommunikationsmoleküle, die von Bakterien in hoher Dichte freigesetzt werden, Wirtsreaktionen entweder direkt oder durch Regulierung bakterieller Gene modulieren. Beispiele in diesem Zusammenhang sind Quorum-Sensing-Peptide verschiedener Bacillus-Arten, die von Darmzellen aufgenommen werden und zur Homöostase eukaryotischer Zellen beitragen, indem sie Überlebenswege aktivieren (p38 MitogenActivatedProteinKinase (MAPK) und Proteinkinase B)13,14. In einigen Fällen wurden die sekretierten bakteriellen Effektoren nicht identifiziert: Es wurde festgestellt, dass von L. reuteri sekretierte Moleküle die durch Tumornekrosefaktor (TNFα) induzierte Apoptose in von myeloischer Leukämie abgeleiteten Zellen verstärken, indem sie die Aktivierung des Kernfaktors-kB (NF-kB) unterdrücken durch Hemmung des IkBa-Abbaus, Herunterregulierung nuklearer Faktor-kB (NF-kB)-abhängiger Genprodukte und Förderung der Apoptose durch Steigerung der MAPK-Aktivitäten, einschließlich c-Jun N-terminaler Kinase und p38 MAPK15.

In diesem Zusammenhang untersucht unsere Studie die In-vitro-Wirkungen bioaktiver Moleküle, die von einem L. gasseri-Stamm produziert und sezerniert werden, auf kolorektale HCT116-Zellen, sowohl auf molekularer als auch auf zellulärer Ebene. L. gasseri ist eine der wichtigsten homofermentativen Lactobacillus-Arten des menschlichen Darms und der Stamm SF1183 wurde aus einer Ileumbiopsie eines gesunden Freiwilligen isoliert16. Insbesondere wurde es aus einer Subpopulation von Bakterien isoliert, die eng mit den Epithelzellen verbunden sind, und es zeigte sich, dass es antimikrobielle Aktivität gegen eine Reihe von Enteropathogenen aufweist und sowohl im Standardlabor als auch unter simulierten Darmbedingungen einen Biofilm bildet16. Unsere vorherige In-vivo-Studie hat gezeigt, dass SF1183 eine schützende Wirkung auf das Darmepithel hat, die engen Verbindungen stärkt und Dextransulfat-Natrium-induzierte (DSS)-induzierte Kolitis-Symptome verhindert, ohne größere Auswirkungen auf die gesamte mikrobielle Zusammensetzung des Darms17.

Wir liefern hier weitere Beweise dafür, dass L. gasseri SF1183 die HCT116-Homöostase beeinflussen kann, indem es die Zellproliferation auf reversible Weise beeinflusst, die TNF-α-induzierte Apoptose reduziert und die Occludin-Rekrutierung an der Zellperipherie erhöht. Wir haben den Effekt auf molekularer und zellulärer Ebene charakterisiert und dabei Veränderungen der Zellproliferationsmarker und Veränderungen in der Zellform festgestellt, die stark auf eine Verstärkung der Barrierefunktionen hinweisen.

Um die Auswirkungen der von L. gasseri SF1183 sezernierten Moleküle auf die Zytokin-induzierte Apoptose zu untersuchen, wurde die Darmepithelzelllinie HCT116 aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber TNF-α18 ausgewählt. Zur Festlegung der Versuchsbedingungen wurden unterschiedliche TNF-α-Konzentrationen und unterschiedliche Inkubationszeiten zur Behandlung von HCT116-Zellen verwendet (Abb. 1). Die Induktion des apoptotischen Programms wurde durch die Analyse der proteolytischen Spaltung von PARP-1 (Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1) überwacht; Insbesondere der Nachweis der katalytischen PARP-1-Untereinheit (89 kDa), die aus der Caspase-3-Aktivität resultiert, durch Western Blot wurde in unserem Versuchsaufbau als apoptotischer Marker verwendet. Wie erwartet reagierten HCT116-Zellen dosis- und zeitabhängig auf TNFα (Abb. 1). Die Bedingungen von 1 nM TNF-α für 8 Stunden Inkubation wurden für nachfolgende Experimente gewählt, da dadurch eine teilweise PARP-1-Spaltung festgestellt wurde und somit der Nachweis erhöhter oder verringerter Apoptoseniveaus ermöglicht wurde.

HCT116-Zellen reagieren auf TNF-α-induzierte Apoptose (A). HCT116-Zellen wurden 8 Stunden lang mit TNF-α in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Zellen wurden gesammelt und ganze Proteinextrakte wurden durch Western Blot mit Antikörpern gegen gespaltenes PARP-1 und β-Actin analysiert. (B) HCT116-Zellen wurden mit TNF-α 1 nM für 1, 4 oder 8 Stunden inkubiert. Zellen wurden gesammelt und ganze Proteinextrakte wurden durch Western Blot mit Antikörpern gegen gespaltenes PARP-1 und β-Actin analysiert.

Um das konditionierte Medium (CM) für die anschließende Analyse zu erhalten, wurde L. gasseri SF1183 bis zur stationären Phase gezüchtet, das Medium filtersterilisiert und dann 16 Stunden lang zu HCT116-Zellen gegeben (20 % v/v). Danach wurden die Zellen 8 Stunden lang mit 1 nM TNF-α inkubiert (Abb. 2, Spuren 2 und 4) oder nicht (Abb. 2, Spuren 1 und 3), ohne das CM zu entfernen. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen gesammelt, Ganzzellproteinextrakte hergestellt und durch Western Blot mit Antikörpern analysiert, die für das gespaltene 89 kDa PARP-1 (Cell Signaling) spezifisch sind. Wie in Abb. 2 gezeigt, wurde die proteolytische Spaltung von PARP-1 (die in unbehandelten Zellen nachweisbar ist, siehe Spur 1) durch die TNF-α-Behandlung erhöht (Spuren 1 vs. 3) und in Gegenwart von CM in beiden Zellen stark reduziert mit TNF-α behandelt oder nicht (Spuren 1 vs. 2 und 3 vs. 4; p = 0,0002, p < 0,0001). Die Verringerung der Apoptose in Zellen, die nicht mit TNF-α behandelt wurden, ist bemerkenswert und deutet auf eine antiapoptotische Wirkung von Molekülen hin, die im CM von L. gasseri vorhanden sind, auch unter physiologischen Wachstumsbedingungen, bei denen Apoptose auf basaler Ebene auftritt (Abb. 2, Spuren). 1 vs. 2). Es wurde keine Verringerung der Apoptose beobachtet, wenn HCT116-Zellen mit frischem Bakterienmedium behandelt wurden, das mit Milchsäure auf pH 4,0 angesäuert war, was die Möglichkeit ausschließt, dass der mit CM beobachtete Effekt auf die Ansäuerung des Mediums zurückzuführen ist, die durch das fermentative Wachstum von L. verursacht wurde. Gasseri (Daten nicht angezeigt).

Das konditionierte Medium von L. gasseri SF1183 reduziert die Apoptose von HCT116-Zellen. (A) HCT116-Zellen wurden, sofern angegeben, 16 Stunden lang mit CM inkubiert oder nicht; Danach wurden die Zellen, sofern angegeben, weitere 8 Stunden mit TNF-α 1 nM inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und die Extrakte mittels Western Blot mit Antikörpern gegen gespaltenes PARP-1 und β-Actin analysiert. (B) Quantifizierung der normalisierten gespaltenen PARP-1-Spiegel aus drei unabhängigen Replikaten, durchgeführt von ImageLab. Statistische Analysen wurden mittels ungepaartem T-Test durchgeführt. Signifikanzniveaus sind angegeben (***p = 0,0002, **** p < 0,0001).

Die vom CM ausgeübte antiapoptotische Wirkung war auf Proteinmoleküle mit einer Größe von weniger als 3 kDa zurückzuführen, deren Charakterisierung derzeit durchgeführt wird (ergänzende Abbildung 1).

Um die Auswirkungen des CM von L. gasseri SF1183 auf HCT116-Zellen zu charakterisieren, führten wir einen MTT-Assay durch, um die Lebensfähigkeit von HCT116-Zellen zu analysieren, die 24 Stunden lang in Gegenwart von CM gezüchtet wurden. Wie in Abb. 3A gezeigt, verursachte das CM eine 30-prozentige Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen (p < 0,0001). Eine ähnliche Verringerung wurde bei der Auswertung der HCT116-Zellzahl beobachtet, die unter den gleichen Bedingungen wie für das MTT-Experiment gemessen wurde (Abb. 3B; p < 0,0001), was darauf hindeutet, dass die Verringerung der Lebensfähigkeit auf eine Verringerung der Zellzahl zurückzuführen war und nicht von ihrer metabolischen Aktivität, was uns die Hypothese erlaubt, dass das CM von L. gasseri Moleküle enthält, die die Proliferation von HCT116-Zellen hemmen können. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Western-Blot-Analysen von Biomarkern der Zellproliferation durchgeführt. Wir beobachteten eine drastische Induktion der Zellzyklus-Arrestmarker p53 und p21WAF (ca. 2,5- bzw. 8-facher Anstieg; 0,00482; p = 0,0088) und eine Verringerung eines Zellproliferationsmarkers (Cyclin D1) in Zellen, die 24 Stunden lang mit CM inkubiert wurden ( Abb. 3), was unsere Hypothese voll und ganz unterstützt.

Das konditionierte Medium von L. gasseri SF1183 reduziert die Proliferation von HCT116-Zellen. (A) Proliferierende HCT116-Zellen wurden in vollständigen Zellkulturmedien, ergänzt oder nicht mit CM (20 % v/v), 16 Stunden lang inkubiert; Danach wurden die Zellen aus CM ausgewaschen und für den MTT-Assay behandelt. Statistische Analysen wurden mithilfe des ungepaarten T-Tests durchgeführt. Signifikanzniveaus zwischen Ausdruckspunkten sind angegeben (**** p < 0,0001). (B) Proliferierende HCT116-Zellen wurden 16 Stunden lang in vollständigen Zellkulturmedien inkubiert, die mit CM (20 % v/v) ergänzt waren oder nicht; Danach wurden die Zellen aus CM ausgewaschen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen gesammelt und gezählt. Signifikanzniveaus zwischen Ausdruckspunkten sind angegeben (**** p < 0,0001). (C) Proliferierende HCT116-Zellen wurden 16 Stunden lang in vollständigen Zellkulturmedien, ergänzt mit CM, wo angegeben, inkubiert; Danach wurden die Zellen gesammelt, ganze Zellextrakte hergestellt und mittels Western Blot mit Antikörpern gegen p53, p21, CyclinD1, b-Actin und Gapdh analysiert. (D) Quantifizierung der normalisierten Proteinspiegel aus drei unabhängigen Replikaten, durchgeführt von ImageLab. Statistische Analysen wurden unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests durchgeführt. Signifikanzniveaus zwischen Ausdruckspunkten sind angegeben (* p = 0,00482; ** p = 0,0088).

Der negative Effekt des CM auf die Proliferation von HCT116-Zellen war teilweise reversibel. Wie in Abb. 4A gezeigt, kam es bei HCT116-Zellen, die 16 Stunden lang in Gegenwart von CM gezüchtet wurden, zu einem Stillstand der Zellproliferation (geschlossene Quadrate in Abb. 4A), der sich teilweise umkehrte, als das CM entfernt, die Zellen gewaschen und in frischem Medium resuspendiert wurden (geschlossen). Dreiecke in Abb. 4A) (p < 0,0001). Die teilweise Wiederherstellung des Zellwachstums nach der CM-Entfernung wurde durch die durch die CM-Behandlung induzierte Verringerung der intrazellulären Spiegel von p53 und p21WAF (Abb. 4B) bestätigt. Insgesamt deuten die Ergebnisse von Abb. 4 darauf hin, dass die CM von L. gasseri SF1183 einen reversiblen Effekt auf die HCT116-Zellproliferation hat.

Das konditionierte Medium von L. gasseri SF1183 beeinflusst die HCT116-Proliferation auf reversible Weise. (A) Wachstumskurve von HCT116-Zellen, die entweder in vollständigem Medium (Kontrolle, Kreise) oder in mit CM ergänztem Medium (Quadrate) gewachsen sind. Die Zellen wurden auch 16 Stunden lang in Gegenwart von CM gezüchtet; Danach wurden die Zellen aus CM ausgewaschen und insgesamt bis zu 24 und 48 Stunden lang wachsen gelassen (Kurve mit Dreiecken). Statistische Analysen wurden mithilfe der 2-Wege-ANOVA und des Mehrfachvergleichstests der Türkei durchgeführt. Signifikanzniveaus (**** p < 0,0001). (B) Nach 24 Stunden Wachstum wurde ein Aliquot der Zellen gesammelt und ganze Proteinextrakte durch Western Blot mit Antikörpern gegen p53, p21 und Gapdh analysiert. Die Bandenintensitäten wurden auf Gapdh jedes Blots normalisiert und als Verhältnis zur Kontrolle ausgedrückt.

Elemente des Zytoskeletts beeinflussen die Bildung von Zell-Zell- und Zell-Substrat-Adhäsionen und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Bildung einer gesunden Magen-Darm-Barriere, deren Funktionen nicht nur mit der Nährstoffaufnahme, sondern auch mit dem Schutz vor Krankheitserregern und Entzündungen zusammenhängen. Um richtig zu funktionieren, muss das Darmepithel aus einer intakten Zellschicht und Verbindungen bestehen, die den Raum zwischen benachbarten Zellen abdichten. Es wurde bereits berichtet, dass L. gasseri SF1183 in vivo auf Tight Junctions einwirkt . Aus diesem Grund haben wir beschlossen, die potenzielle Barrierefunktion von CM zu charakterisieren, indem wir die Rekrutierung von Occludin für Zell-Zell-Kontakte analysieren. Occludin ist ein integrales Membranprotein, das an Tight Junctions angereichert ist und an der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität und der Barrierefunktionen beteiligt ist. Wir führten Immunfluoreszenzexperimente (IF) nach CM-Inkubation durch (Abb. 5). Man ließ die Zellen über Nacht auf Deckgläsern haften, behandelte sie wie üblich 16 Stunden lang mit CM, fixierte sie und unterzog sie einer IF mit Anti-Occludin, gefolgt von DAPI, um die Kerne gegenzufärben. Interessanterweise beobachteten wir eine deutliche Rekrutierung von Occludin bei Zell-Zell-Kontakten behandelter Zellen (Abb. 5 A, Vergleich oberes und unteres Bild). Interessanterweise wird bei der Behandlung eine drastische Veränderung der Zellmorphologie sichtbar, was darüber hinaus auf eine Verstärkung der engen Zell-Zell-Verbindungen hindeutet. Bemerkenswerterweise stieg, wie in Abb. 5B gezeigt, der Gesamtgehalt an Occludin-Protein bei der CM-Behandlung nicht an, was die Hypothese stützt, dass während des L. gasseri-Wachstums sezernierte Moleküle eine Verstärkung der Barrierefunktionen induzieren, die durch die Relokalisierung von Occludin in die Zellperipherie verursacht wird. Diese Beobachtung führte zu der Hypothese, dass der Apoptoseschutz auf der Verstärkung der Barrierefunktionen beruhen könnte, die durch Moleküle verursacht werden, die während des Wachstums von L. gasseri sezerniert werden.

Das konditionierte Medium von L. gasseri SF1183 beeinflusst HCT116 und übt eine umfassendere Schutzwirkung auf HCT116-Zellen aus. (A) HCT116-Zellen wurden auf Deckgläser ausgesät und wo angegeben 16 Stunden lang mit CM behandelt. Die Zellen wurden durch IF mit Anti-Occludin fixiert und analysiert, gefolgt von DAPI zur Gegenfärbung der Kerne. Repräsentative Bilder wurden mit dem konfokalen Zeiss-Mikroskop aufgenommen. Maßstabsbalken 5 μm. (B) HCT116-Zellen wurden 16 Stunden lang mit CM 20 % v/v inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und die Extrakte mittels Western Blot mit Antikörpern gegen Occludin und Gapdh analysiert.

Das Gleichgewicht zwischen Zelltod und -proliferation gehört zu den wichtigsten homöostatischen Mechanismen für die Gesundheit von Geweben, insbesondere bei solchen, die durch eine hohe Zellerneuerungsrate gekennzeichnet sind, wie etwa das Darmepithel. In dieser Hinsicht spielen probiotische Bakterien wie die Gattungen Lactobacillus und Bifidobacterium eine wichtige Rolle, einschließlich der Modulation von Entzündungen, der Reduzierung des oxidativen Stresses und der Kontrolle der Zellproliferation19,20,21,22,23. Besonders faszinierend ist die Beteiligung kommensaler Bakterien an entzündlichen Darmerkrankungen, die als IBDs (Entzündliche Darmerkrankungen) bekannt sind, darunter UC (Colitis ulcerosa) und CD (Chronische Erkrankungen). In einigen Fällen konnte gezeigt werden, dass Probiotika eine Remission entzündlicher Erkrankungen bewirken, auch indem sie die Konzentration von entzündlichen Zytokinen beeinflussen und so eine schützende Wirkung auf die Darmbarriere ausüben2,3,4,5,6,23 Tatsächlich ist dies ein häufiges Merkmal von Darmerkrankungen Bei Entzündungen kommt es zu einem Anstieg der entzündlichen Zytokine, der wiederum zur Apoptose der Epithelzellen mit einer Störung der Darmbarriere führt. Andererseits führt der Verlust der Epithelintegrität dazu, dass unverdaute Nahrung, toxische Substanzen, Bakterienmoleküle und Mikroben in die submuköse Schicht eindringen, was lokale Entzündungen und auch systemische Auswirkungen weiter verstärkt. Zu den bei diesen Erkrankungen am häufigsten produzierten Zytokinen gehört der proinflammatorische Tumornekrosefaktor Alpha, TNF-α, der bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Gleichgewichts zwischen Zellproliferation und Apoptose spielt. Abhängig von den zellulären Bedingungen ist TNF-α in der Lage, das Überleben oder den Zelltod der Zelle zu vermitteln24. Pharmakologische Interventionen mit Anti-TNFα-Behandlungen (Kortikosteroide und/oder monoklonale Antikörper) stellen einen potenziellen therapeutischen Ansatz bei IBDs dar24, obwohl ein gewisses Maß an Toxizität beobachtet werden kann. In einigen Fällen wurden Probiotika allein25 oder in Kombination mit Antikörpern gegen TNF-α zur Behandlung von Darmentzündungen26 eingesetzt. Unsere Beobachtung, dass ein Stamm von L. gasseri SF1183 in der Lage ist, Darmepithelzellen vor TNF-α-induzierter Apoptose zu schützen, steht im Einklang mit diesen Ansätzen. Es ist zu beachten, dass dieser Stamm aus dem Darm eines gesunden Individuums stammt, was seinen Nutzen für den Darm begründet. Andererseits ist L. gasseri eine häufige probiotische Art mit bekannten Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit27. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Stamm SF1183 in einem Mausmodell der DSS (Dextran-Sulfat-Natrium)-induzierten Kolitis eine schützende Wirkung entfalten kann, indem er die Integrität der Darmbarriere stärkt, ohne die Zusammensetzung der Darmflora zu verändern17. Wir fügen weitere Beweise für die vorteilhaften Wirkungen des SF1183-Stamms hinzu, die Einblicke auf zellulärer und molekularer Ebene geben. Von L. gasseri sezernierte Moleküle hemmen die Zellproliferation auf reversible Weise, indem sie auf den p53/p21WAF-Signalweg einwirken. Obwohl die genauen molekularen Mechanismen nicht bekannt sind, könnte der intrazelluläre Anstieg von p21WAF, einem sehr bekannten Regulator des Zellzyklusstopps28, den letzten Effektor des CM-Effekts auf HCT116-Zellen darstellen. Andererseits gilt p21WAF auch als antiapoptotischer Marker, der offenbar eine entscheidende Rolle als Modulator der Apoptose durch verschiedene zelluläre Mechanismen spielt29. Vorläufige Ergebnisse zu den potenziell bioaktiven Molekülen, die im CM verantwortlich sind, deuten auf das Vorhandensein von Molekülen proteinartiger Natur hin, die kleiner als 3 kDa sind. Solche Metaboliten können, sobald sie identifiziert und isoliert sind, direkte positive Auswirkungen auf die Gesundheit haben und als Postbiotika Anwendung finden30.

Interessanterweise zeigen mit CM behandelte HCT116-Zellen eine drastische Veränderung der Zellform mit einer deutlichen Relokalisierung von Occludin an der Zellperipherie, was auf eine Verstärkung der engen Zell-Zell-Verbindungen hinweist. Frühere In-vivo-Beweise stimmen mit dieser Beobachtung überein, wenn man bedenkt, dass die orale Verabreichung von L.gasseri SF1183 an DSS-behandelte Mäuse eine deutliche Occludin-Färbung auf der Epitheloberfläche zeigt, ähnlich wie bei der unbehandelten Kontrolle, was auf ein wiederhergestelltes Epithel hinweist17. Obwohl unsere Analysen unter völlig anderen Bedingungen durchgeführt wurden (an kultivierten menschlichen Zellen, die mit konditioniertem L. gasseri-Medium inkubiert wurden, dh mit abgesonderten potenziell bioaktiven Molekülen), stimmen unsere aktuellen Ergebnisse mit denen überein, die zuvor in vivo erzielt wurden. Interessanterweise führt die Inkubation mit CM unter unseren Bedingungen nicht zu einem Anstieg der Occludinspiegel, sondern stattdessen zu einer Relokalisierung zu Zell-Zell-Kontakten.

Die molekulare Natur der sekretierten Moleküle sowie Einzelheiten zu den molekularen Signalwegen, die an den beobachteten Effekten beteiligt sind, werden zukünftige anspruchsvolle Aufgaben sein. All diese Beobachtungen sowie die Reversibilität der auf menschliche Zellen ausgeübten Wirkungen weisen stark darauf hin, dass L. gasseri SF1183 ein sicheres und vielversprechendes therapeutisches Instrument zur Linderung von Darmentzündungszuständen ist.

Der Stamm SF1183 Lactobacillus gasseri wurde in MRS-Brühe (Difco, Detroit, Michigan, USA) 24 Stunden lang bei 37 °C gezüchtet und die verdünnte Kultur wurde in definiertem Minimalmedium (MDM; Glucose 10 g/l, Natriumacetat 5 g/l) beimpft. L, KH2PO4 3 g/L, K2HPO4 3 g/L, MgSO4 *7H2O 0,2 g/L, L-Alanin 100 mg/L, L-Arginin 100 mg/L, L-Asparaginsäure 200 mg/L, L-Cystein200 mg/L, L-Glutamin 200 mg/L, L-Histidin 100 mg/L, L-Isoleucin 100 mg/L, L-Leucin 100 mg/L, L-Lysin 100 mg/L, L-Methionin 100 mg/L L, L-Phenylalanin 100 mg/L, L-Serin 100 mg/L, L-Tryptophan 100 mg/L, L-Tyrosin 100 mg/L, L-Valin 100 mg/L, Nikotinsäure 1 mg/L, Pantothensäure 1 mg /L, Pyridoxal 2 mg/L, Riboflavin 1 mg/L, Cyanocobalamin 1 mg/L, Adenin 10 mg/L, Guanin 10 mg/L, Uracil 10 mg/L). Anschließend wurden SF1183-Zellen 48 Stunden lang bei 37 °C anaerob gezüchtet. Die Kultur wurde zentrifugiert (5000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT)) und der Überstand (konditioniertes Medium, CM) wurde durch einen 0,22 μm-Filter mit geringer Proteinbindung (Millipore, Bedford, MA, USA) filtriert und sterilisiert.

Menschlicher Dickdarm HCT116 (ATCC CCL-247) war ein Geschenk von Prof. Marina De Rosa und wurde routinemäßig bei 37 °C und 50 % Konfluenz in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator in RPMI-1640 (Euroclone), ergänzt mit 10 % (v /v) FBS (Euroclone), 1 % Penicillin-Streptomycin (Euroclone), 1 % L-Glutamin (Euroclone). Das bakterielle CM wurde 16 Stunden lang in einer Konzentration von 10 % und 20 % v/v in vollständigem RPMI-Wachstumsmedium getestet. Die letztgenannte Konzentration ergab deutlichere Ergebnisse bei der Reduzierung der PARP-1-Spaltung und wurde für alle weiteren Experimente ausgewählt; MDM (bakterielles Wachstumsmedium) wurde in einer Konzentration von 20 % v/v im vollständigen Wachstumsmedium für Kontrollproben verwendet. Wo angegeben, wurde TNF-α (1 nM) (Millipore, Mailand, Italien) zu den Zellen hinzugefügt, ohne das CM zu entfernen, und die Zellen wurden nach 8-stündiger Behandlung geerntet.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe des MTT-Assays (Sigma-Aldrich) bewertet. Es basiert auf der Reduktion des Tetrazoliumrings von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) durch mitochondriale Dehydrogenasen, wodurch ein violetter Farbstoff (Formazan) entsteht, der gemessen werden kann spektrophotometrisch; Die Menge an produziertem Formazan ist proportional zur Anzahl lebensfähiger Zellen31. HCT116-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät (9 × 103 Zellen/Vertiefung). Die Zellen wurden dann wie beschrieben mit 20 % v/v CM behandelt und 3 Stunden lang bei 37 °C mit einer 1× MTT-Lösung, verdünnt in DMEM ohne Phenolrot, inkubiert; Der Überstand wurde entfernt und jeder Vertiefung wurde saures Isopropanol (0,01 N) zugesetzt, um die gebildeten unlöslichen Formazankristalle aufzulösen. Die Absorption der Proben wurde bei 570 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Multiskan Spectrum, Thermo)32 gemessen.

Zur Zellproliferationsanalyse wurden HCT116-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen in einer Dichte von 2,5 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang in Gegenwart von 20 % v/v inkubiert. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen gesammelt und die Anzahl der Zellen an jedem Versuchspunkt mit dem Scepter-Millipore-Zähler (Handheld Automated Cell Counter) gezählt.

Für die Western-Blot-Analyse wurden die Zellen in Lysepuffer geerntet und wie beschrieben verarbeitet33. Anschließend wurden die Proteine ​​mit einem Mini-Trans-Blot-Gerät (Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF, Millipore) übertragen. Die Membran wurde dann mit den angegebenen Antikörpern inkubiert. Primärantikörper waren Anti-Kaninchen-gespaltenes PARP-1 (Cell signaling EuroClone, Mailand, Italien 95415-S), Anti-Kaninchen-p21WAF1 (Thermo Fisher, Invitrogen, Thermo Fisher Italien 14-671581) und Anti-Kaninchen-Cyclin D1 (SP4, Invitrogen). , Thermo Fisher Italien, MA5-16356) Anti-Maus-β-Actin (C4 Santa-Cruz Biotechnology DBA Mailand, Italien SC-47778), Anti-Maus-Gapdh (6C5 Santa-Cruz Biotechnology DBA Mailand, Italien, SC-32233), Anti-Maus-p53 (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan MABE327). Sekundärantikörper waren Anti-Kaninchen-HRP (Sigma Aldrich Merck Millipore Mailand Italien 12-348) und Anti-Maus (Sigma Aldrich Merck Millipore Mailand Italien A9044). Proteine ​​wurden durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL, Bio-Rad) sichtbar gemacht und mit der Quantity One-Software des ChemiDoc TM XRS-Systems (Bio-Rad) sichtbar gemacht. Die Bandenintensitäten wurden mit der ImageLab BioRad-Software quantifiziert, in Bezug auf die Beladungskontrollen normalisiert und als fache Zunahme/Reduktion in Bezug auf die Kontrollprobe angegeben. Für jeden Blot werden repräsentative Experimente gezeigt.

Die Original-Blots wurden beschnitten, um unnötige Proben zu eliminieren, und werden als Rohdaten in den Zusatzinformationen angezeigt.

Für IF-Experimente wurden Zellen in 24-Well-Platten mit 105 Zellen/Well ausplattiert, 16 Stunden lang mit 20 % v/v CM behandelt und wie in34,35,36 beschrieben behandelt. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit Paraformaldehyd (PFA) 3,7 % fixiert und mit Anti-Occludin-Antikörpern (Invitrogen Thermo Fisher OC-3F10) 1:250 in PBS 1 × Tween 0,05 % inkubiert, gefolgt von einem Anti-Maus-Cy3-konjugierten Sekundärantikörper (Invitrogen Thermo Fisher). Alexa Fluor Farbstoff 488) 1:500 in PBS 1× Tween 0,05 %. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Axio Observer von Zeiss (Oberkochen, Deutschland) aufgenommen. Es wurde ein 40-fach-Objektiv verwendet und die Bildanalyse wurde mit ImageJ34 durchgeführt.

Alle Daten werden als Mittelwerte von mindestens drei biologischen Replikaten ± Standardfehler (SE) ausgedrückt. Die Varianzanalyse wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA oder eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests durchgeführt. Die statistische Analyse wurde mit Graph-Pad Prism (Graph-Pad-Software) durchgeführt.

Die in dieser Studie präsentierten Daten sind im Haupttext, in den Abbildungen und im ergänzenden Material verfügbar.

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Diese Forschung erhielt Mittel von der Universität Neapel Federico II (Mittel MUR Ministero Università Ricerca-FRA Finanziamento della Ricerca di Ateneo 2021) und Abteilungsforschungsfonds 2021 an AP und ER.

Abteilung für Biologie, Universität Federico II, Neapel, Italien

Blanda Di Luccia, Vittoria Acampora, Anella Saggese, Viola Calabrò, Maria Vivo, Tiziana Angrisano, Ezio Ricca und Alessandra Pollice

Abteilung für Molekulare Medizin und Medizinische Biotechnologie, Universität Federico II, Neapel, Italien

Loredana Baccigalupi

Abteilung für Chemie und Biologie A. Zambelli, Universität Salerno, Salerno, Italien

Maria Vivo

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University-School of Medicine, Stanford, CA, USA

Blanda Di Luccia

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BdL, VA und AS führten die meisten Experimente durch; BdL und AS trugen zur CM-Produktion bei; MV trug zum IF-Experiment und zur kritischen Lektüre des Manuskripts bei; VC und TA trugen zu Designexperimenten, Diskussionen und der kritischen Lektüre des Manuskripts bei; LB trug zu Diskussionen, Vorschlägen und zum Verfassen von Manuskripten bei; AP und ER entwarfen die Experimente, überwachten das Projekt und verfassten die Arbeit. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ezio Ricca oder Alessandra Pollice.

Einer der Autoren (E. Ricca) fungiert als Berater für Synergia Life Sciences (Indien) bei der Kommerzialisierung probiotischer Stämme. Synergia Life Sciences (Indien) hat kommerzielle Rechte an dem in dieser Studie verwendeten Stamm (Lactobacillus gasseri SF1183) erworben, war jedoch nicht am Design der Studie, an der Sammlung, Analyse oder Interpretation von Daten oder am Verfassen des Manuskripts beteiligt .Alle anderen Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Di Luccia, B., Acampora, V., Saggese, A. et al. Modulation der Proliferation und Apoptose von Darmepithelzellen durch Lactobacillus gasseri SF1183. Sci Rep 12, 20248 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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Eingegangen: 24. August 2022

Angenommen: 16. November 2022

Veröffentlicht: 24. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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