Beeinträchtigung des Aβ-Ausflusses und Entzündung im Zusammenhang mit der zerebrovaskulären Ansammlung von Amyloid

Apr 07, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 2 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Beeinträchtigung der Gefäßwege der zerebralen β-Amyloid (Aβ)-Elimination trägt zur Alzheimer-Krankheit (AD) bei. Gefäßschäden gehen häufig mit Diabetes einher. Hier zeigen wir in menschlichen Geweben und AD-Modellratten, dass durch Blut übertragenes Insel-Amyloid-Polypeptid (Amylin), das von der Bauchspeicheldrüse abgesondert wird, die zerebrale Aβ-Clearance stört. Die Amylinkonzentration im Blut ist bei AD höher als bei kognitiv nicht betroffenen Personen. Amyloidbildendes Amylin reichert sich in zirkulierenden Monozyten an und lagert sich gemeinsam mit Aβ im Mikrogefäßsystem des Gehirns ab, was möglicherweise zu Entzündungen führt. Bei Ratten induziert die Expression von amyloidbildendem menschlichem Amylin in der Bauchspeicheldrüse tatsächlich eine zerebrovaskuläre Entzündung und Amylin-Aβ-Koablagerungen. Der LRP1-vermittelte Aβ-Transport über die Blut-Hirn-Schranke und die Aβ-Clearance durch interstitielle Flüssigkeitsdrainage entlang der Gefäßwände sind beeinträchtigt, was durch die Aβ-Ablagerung in perivaskulären Räumen angezeigt wird. Auf molekularer Ebene verändern zerebrovaskuläre Amylinablagerungen die immun- und hypoxiebedingte Genexpression im Gehirn. Diese übereinstimmenden Daten von Menschen und Labortieren legen nahe, dass eine Veränderung des im Blut übertragenen Amylins möglicherweise zerebrovaskuläre Amylinablagerungen und die Aβ-Pathologie reduzieren könnte.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist durch eine Überexpression und/oder eine beeinträchtigte Clearance von Aβ gekennzeichnet, die mit einer früh einsetzenden genetischen Veranlagung für die Aβ-Pathologie (familiäre AD) zusammenhängen oder sporadisch mit zunehmendem Alter auftreten können (sporadische AD)1. Die Faktoren, die das Gleichgewicht zwischen effektiver Eliminierung und Akkumulation von Aβ ausmachen, sind noch nicht vollständig definiert. Zu den gut etablierten Wegen der Aβ-Clearance im Gehirn gehören der interstitielle Flüssigkeitsabfluss entlang der Wände von Gehirnblutgefäßen, der Transport über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und der Stoffwechsel durch Mikroglia und perivaskuläre Makrophagen2,3,4.

Amylin (auch als Insel-Amyloid-Polypeptid bekannt) ist ein Pankreas-β-Zellhormon, das gemeinsam mit Insulin freigesetzt wird, die Blut-Hirn-Schranke passiert und an der zentralen Regulierung der Sättigung beteiligt ist. Bei Personen mit Typ-2-Diabetes mellitus (Typ-2-DM) bildet Amylin Pankreas-Amyloid8,9,10 (>95 % Prävalenz bei Autopsie)10 und ist mit einer Pankreasentzündung verbunden11,12,13. Daten verschiedener Forschungsteams zeigen, dass Amylin bei sporadischer und familiärer AD14,15,16,17,18,19,20,21 synergistisch mit Aβ im Parenchymgewebe des Gehirns aggregiert und sich auch in Arteriolen und Kapillaren des Gehirns ablagert ,22,23,24. Höhere Konzentrationen von aus der Bauchspeicheldrüse stammendem Amylin im Zentralnervensystem sind mit einer erhöhten Häufigkeit kognitiver Beeinträchtigungen verbunden21,22,23,24. Bei APPswe/PS1dE9 (APP/PS1)-Ratten beschleunigt die pankreatische Expression von menschlichem Amylin (Nagetier-Amylin ist nicht amyloidogen) Verhaltensdefizite und die Aβ-Ablagerung im Gehirn21. Bei Ratten ohne Aβ-Pathologie (HIP-Ratte) fördert die pankreatische Expression von amyloidbildendem menschlichem Amylin zerebrovaskuläre Amylinablagerungen, die zu Neuroinflammationen18,25,26 und neurologischen Defiziten18,21,25 führen. Diese Daten bilden die Grundlage unserer Hypothese, dass erhöhte Konzentrationen von amyloidbildendem Amylin im Blut die zerebrovaskuläre Amylinablagerung fördern und entscheidende Faktoren für perivaskuläre Entzündungen und gestörte Aβ-Clearance bei AD sind. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen aus der Bauchspeicheldrüse stammendem Amylin im Blut und einer beeinträchtigten Aβ-Clearance im Gehirn zu ermitteln, haben wir die Amylinkonzentrationen im Blut von Menschen mit Demenz vom AD-Typ im Vergleich zu kognitiv nicht beeinträchtigten Personen gemessen und die Beziehungen mit Aβ im Gehirnparenchym und in den Gefäßen bewertet. Um den Mechanismus zu verstehen und neue therapeutische Ziele zur Reduzierung/Verhinderung der Entwicklung einer Aβ-Pathologie im Gehirn aufzudecken, führten wir vergleichende pathophysiologische Charakterisierungen der Clearance-Wege von Aβ im Gehirn bei transgenen Ratten durch, die Amyloid-bildendes menschliches Amylin in der Bauchspeicheldrüse exprimieren, im Vergleich zu Kontrollratten, die endogenes, nicht exprimiertes menschliches Amylin exprimieren -amyloidogenes Ratten-Amylin. Die Ergebnisse dieser Studie könnten zu einem besseren Verständnis darüber beitragen, wie die Veränderung von im Blut übertragenem Amylin als therapeutische Strategie eingesetzt werden kann, um möglicherweise zerebrovaskuläre Amylinablagerungen und die Aβ-Pathologie zu reduzieren.

Die in unserer Studie getestete Gesamthypothese sowie der Arbeitsablauf und die Methoden sind in Abb. 1a, b grafisch beschrieben. Mittels ELISA haben wir die Amylinkonzentrationen in Blutproben von kognitiv unbeeinträchtigten Personen (CU; n = 42) und Personen mit Demenz vom sAD-Typ (DEM; n = 19) oder leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI; n = 19) gemessen (siehe Tabelle). 1 für zusammenfassende Statistiken zu Alter und Geschlecht). Die Gruppen hatten ähnliche Blutzuckerkonzentrationen (112,9 ± 5,71 mg/dl vs. 119,1 ± 9,43 mg/dl vs. 113,2 ± 5,10 mg/dl; einfache ANOVA, P = 0,79) und Alter (79,35 ± 2,18 Jahre vs. 81,35 ±). 1,78 Jahre vs. 77,60 ± 0,66 Jahre; einfache ANOVA, P = 0,14). Beschreibende Statistiken der Blut-Amylin-Konzentrationen sind in der ergänzenden Abbildung S1a dargestellt. Die Blut-Amylin-Konzentrationen waren in den DEM-Gruppen höher als in den CU-Gruppen (Abb. 1c) (einseitige Varianzanalyse nach Kruskal-Wallis, P < 0,001). In Gruppen, die nach Typ-2-DM-Status aufgeteilt wurden, waren die Amylinkonzentrationen im Blut sehr unterschiedlich (ergänzende Abbildung S1b), was möglicherweise auf die Wirkung von Antidiabetika zurückzuführen ist. Ein möglicher Zusammenhang zwischen erhöhten Amylinkonzentrationen im Blut und Diabetes wurde weiter untersucht, indem die Amylin-Insulin-Beziehung in denselben Blutproben wie in Abb. 1c gemessen wurde. Insulin- und Amylin-ELISAs zeigen, dass erhöhte Insulinkonzentrationen im Blut mit höheren Amylinkonzentrationen im Blut verbunden sind (r = 0,52; P < 0,0001) (Abb. 1d und ergänzende Abb. S1c). Der paarweise Korrelationskoeffizient zeigt, dass Hyperamylinämie und Hyperinsulinämie bei AD korrelieren.

Mutmaßliche Amylin-Funktion (grünes Feld) und Pathologie (rotes Feld) (a) zusammen mit Arbeitsablauf und Methoden (b). c Blut-Amylin-Konzentrationen bei Personen mit Demenz (DEM; n = 19), Personen mit leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI; n = 19) und kognitiv nicht beeinträchtigten Personen (CU; n = 42). d Paarweiser Korrelationskoeffizient (r) zwischen Amylin- und Insulinkonzentrationen in denselben Blutproben wie in (c). e Durchflusszytometrie-Sortierung von Amylin-positiven (Q2) oder negativen (Q1) zirkulierenden CD14+-Monozyten im Blut mit Amylinkonzentrationen im unteren Quartil vs. im oberen Quartil. f Konfokale mikroskopische Bilder, die Amylin zeigen, das in CD14+-Monozyten eingeschlossen ist (n = 3). Paarweiser Korrelationskoeffizient (r) zwischen Amylin- und Aβ42-Konzentrationen in menschlichen Gehirnen, einschließlich Personen mit sAD (n = 42) und ohne AD (n = 18) (g), und zwischen übereinstimmender Antemortal-Plasma-Amylin-Konzentration und Amylin-Konzentration in autopsiertem Hirngewebe , einschließlich Personen mit sAD (n = 12) und Personen ohne AD (n = 8) (h) (potenzielle Ausreißer wurden aus der Analyse entfernt; dargestellt in der ergänzenden Abbildung S1e). i IHC-Analyse mit Anti-Amylin- (braun) und Anti-Aβ-Antikörpern (grün) an Serienschnitten eines sAD-Gehirns (n ​​= 18). j Konfokale mikroskopische Analyse und Amylin-Aβ-Proximity-Ligation-Assay (PLA), die vaskuläre Amylin-Aβ-Ablagerungen in einem sAD-Gehirn zeigen. IHC-Analyse von fAD-Gehirnen zeigt Aβ-Ablagerungen in perivaskulären Räumen und Gefäßwänden mit Amylin-Anreicherung im Lumen (k, l) sowie Amylin-Ablagerungen in der Gefäßwand (m) oder Gefäßwand (n) und Aβ-Ablagerungen in perivaskulären Räumen ( n = 32). Die Daten werden als Box-and-Whisker-Analyse oder als Korrelationsanalyse dargestellt. Kruskal-Wallis-Einfaktorvarianz, Daten sind Mittelwerte ± SEM.

Da eine erhöhte Sekretion von amyloidbildendem Amylin die Amylinakkumulation in Makrophagen und dendritischen Zellen in den Pankreasinseln fördert11,12,13, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass chronisch erhöhte Amylinspiegel im Blut eine systemische Entzündung auslösen. Mithilfe der Durchflusszytometrie sortierten wir Fraktionen zirkulierender CD14+-Monozyten, die positiv auf Amylin waren. Wir haben die Fraktionen zirkulierender Monozyten, die positiv auf Amylin (Q2) und negativ auf Amylin (Q1) sind, in Blutproben mit Amylinkonzentrationen im oberen Quartil (>3,5 pM) und in solchen mit Amylinkonzentrationen im unteren Quartil (<1,5 pM) quantifiziert. . Blutproben mit Amylinkonzentrationen im oberen Quartil (>3,5 pM) enthielten erhöhte Anteile an CD14+-Monozyten, die positiv für Amylin waren (Q2) (Abb. 1e). Die konfokale mikroskopische Bildgebung bestätigte Amylin-Einschlüsse in zirkulierenden CD14+-Monozyten (Abb. 1f).

Als nächstes wollten wir mögliche Zusammenhänge zwischen einer erhöhten Amylinkonzentration im Blut und der Amylin- und Aβ-Akkumulation im Gehirn darstellen. Mittels ELISA haben wir die Konzentrationen von Amylin und Aβ42 in Homogenaten des temporalen Kortex von Personen mit sAD gemessen, die durch gut etablierte neuropathologische Merkmale identifiziert wurden27,28,29,30,31 (n = 42; n = 22 mit Typ-2-DM) und von Einzelpersonen ohne sAD-Pathologie (n = 18; n = 6 mit Typ-2-DM) (klinische Daten siehe Tabelle 2). Die Individuen sind im Alter ähnlich (85,65 ± 7,04 Jahre vs. 87,22 ± 7,30 Jahre), in der sAD-Gruppe gegenüber der Nicht-AD-Gruppe. Die Amylinkonzentrationen im Gehirn waren bei Personen aus der sAD höher als bei denen in der Kontrollgruppe (ungepaarter t-Test, P < 0,01) (ergänzende Abbildung S1d), was mit früheren Ergebnissen aus anderen Kohorten übereinstimmt15,21. Es gab keinen Unterschied in den Amylinspiegeln im Gehirn zwischen denen mit Typ-2-DM und solchen ohne (ergänzende Abbildung S1e); Die Analyse berücksichtigte jedoch weder die potenziellen Auswirkungen glykämischer Medikamente noch die Medikamente, die Personen mit kognitiven Beeinträchtigungen verabreicht wurden. Erhöhte Amylinkonzentrationen im Gehirn waren mit höheren Aβ42-Konzentrationen verbunden (r = 0,34; P < 0,05) (Abb. 1g), was mit der kürzlich in fAD-Gehirnen identifizierten Amylin-Aβ42-Beziehung übereinstimmt21. Unter Verwendung passender Plasma- und Hirngewebehomogenate, die in dieser Kohorte verfügbar waren (n = 12 in der sAD-Gruppe, n = 8 Kontrollen), beurteilten wir die Beziehung zwischen den Amylinkonzentrationen im antemortalen Plasma und den Amylinkonzentrationen im autopsierten Hirngewebe. Der paarweise Korrelationskoeffizient deutet auf einen möglichen Zusammenhang zwischen den zirkulierenden Amylinspiegeln und der Neigung von Amylin, sich im Gehirn anzusammeln, hin (r = 0,40; P = 0,09) (Abb. 1h) (die Analyse schloss potenzielle Ausreißer der Amylinkonzentrationen im Gehirngewebe aus; ergänzende Abb. S1e). Eine Einschränkung stellt die geringe Probengröße passender Plasma- und Gehirnproben dar.

Um eine mögliche Überlappung von Amylin und Aβ an der BHS zu testen, analysierten wir sAD- und fAD-Gehirne auf histologische Hinweise auf eine vaskuläre Amylin-Aβ-Co-Lokalisierung mithilfe von Immunhistochemie (IHC), konfokaler Mikroskopie und Proximity-Ligation-Assay (PLA) mit Anti-Amylin und Anti-Aβ-Antikörper. Für die Entfaltung und Analyse der Intensitätssignale der Amylin-Immunreaktivität auf IHC-Bildern diente Pankreasgewebe eines Patienten mit Typ-2-DM als positive Kontrolle für die Amylin-Ablagerung (ergänzende Abbildung S1f). Die histopathologische Analyse der zerebrovaskulären Amylin-Aβ-Co-Lokalisierung ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Repräsentative Bilder von Serienschnitten und IHC-Färbung mit Anti-Amylin-, Anti-Aβ- und kombinierten Anti-Amylin- und Anti-Aβ-Antikörpern in temporalen Kortexgeweben aus einem 83- Jahre alte Frau mit sAD und Typ-2-DM sind in Abb. 1i dargestellt. Konfokale mikroskopische Analyse und PLA mit denselben Anti-Amylin- und Anti-Aβ-Antikörpern bestätigten die zerebrovaskuläre Amylin-Aβ-Ablagerung weiter (Abb. 1j). Das PLA-Signal zeigt insgesamt eine Konsistenz mit einer Amylin-Aβ-Kolokalisation innerhalb der Arteriolenwand. Zum Vergleich sind in der ergänzenden Abbildung S1g Bilder der IHC-Analyse des temporalen Kortexgewebes einer 86-jährigen kognitiv unbeeinträchtigten Frau ohne Typ-2-Diabetes dargestellt. In Abb. 1k – n und ergänzenden Abbildungen. S1h präsentieren wir zusätzliche Beispiele der zerebrovaskulären Amylin-Aβ-Co-Lokalisierung aus IHC-Analysen in einer Untergruppe von Gehirnen von Patienten mit fAD und mit dokumentierter Amylin-Akkumulation durch IHC und ELISA21. Aβ-Ablagerungen sind in perivaskulären Räumen und Arterienwänden vorhanden, wohingegen sich Amylin im Lumen (Abb. 1k, l), in der Arterienwand (Abb. 1m) und auf der Lumenseite (Abb. 1n) anzusammeln scheint. Die IHC-Analyse wies Amylin in etwa 2/3 der gesamten Blutgefäße nach, die in fAD-Gehirnen positiv auf Aβ gefärbt waren (Tabelle 3). Die konfokale mikroskopische Analyse von Hirnschnitten, die dreifach mit Anti-Amylin-, Anti-Aβ- und Anti-α-Actin-Antikörpern aus glatten Muskelzellen (SMC) gefärbt wurden, stützt weiterhin Co-Lokalisierungsmuster, bei denen Aβ in perivaskulären Bereichen und Amylin in der Blutgefäßwand vorhanden ist (Ergänzende Abbildung S1i).

Unsere Daten zeigen eine Akkumulation von pankreatischem Amyloid-bildendem Amylin im Blut und zirkulierenden Monozyten sowie Amylin, das zusammen mit Aβ im Gehirngefäßsystem bei Personen mit AD lokalisiert ist. Die Ergebnisse legen die Hypothese nahe, dass erhöhte Konzentrationen des amyloidbildenden Amylins im Blut den zerebralen Aβ-Ausfluss stören, was möglicherweise zu einer Entzündung führt.

Wir verwendeten Ratten, deren β-Zellen der Bauchspeicheldrüse menschliches Amylin exprimieren (das HIP-Rattenmodell18), und Wildtyp-Ratten (WT), die das endogene, nicht-amyloidogene Ratten-Amylin exprimieren, um potenziell ursächliche Auswirkungen erhöhter Konzentrationen von amyloidbildendem menschlichem Amylin zu bestimmen Blut auf die Entwicklung systemischer und zerebrovaskulärer Entzündungen. Die Spezifität der Expression menschlicher Amylin-RNA in der Bauchspeicheldrüse und das Fehlen menschlicher Amylin-RNA im Gehirn bei HIP-Ratten wurde, wie bereits berichtet, durch qRT-PCR dokumentiert25. Männliche und weibliche HIP-Ratten entwickeln Typ-2-DM, der mit der Ablagerung von Amylin-Amyloid in der Bauchspeicheldrüse18,32, einer Glukose-Dysregulation18,32 und neurologischen Defiziten18,25 einhergeht. Glukose-Dysregulation und Verhaltensdefizite entwickeln sich bei weiblichen HIP-Ratten im Vergleich zu männlichen HIP-Ratten später (ca. 6 Monate), wie wir bereits berichtet haben18. Die Amylinkonzentration im Blut steigt mit höherem Blutzucker (Abb. 2a). In dem Alter, in dem HIP-Ratten neurologische Defizite entwickeln (~ 16 Monate) (ergänzende Abbildung S2), lagen die Amylinkonzentrationen im Blut bei männlichen HIP-Ratten in einem ähnlichen Bereich wie bei Personen mit kognitivem Rückgang (Abb. 2b).

a Amylin- und Glukosekonzentrationen im Blutquerschnitt bei HIP-Ratten im Alter von 6–8 Monaten (n = 6), im Alter von 10–12 Monaten (n = 13) und im Alter von 15–16 Monaten (n = 12). b Blut-Amylin-Konzentrationen bei Menschen mit Demenz (DEM) im Vergleich zu HIP-Ratten; Dieselben Ratten wie in (n = 16) (a). c Durchflusszytometrie-Sortierung zirkulierender, Amylin-positiver CD14+-Monozyten im Blut derselben Ratten wie in (b) (n = 10 Männchen/Gruppe). d Konfokale mikroskopische Bilder von zirkulierenden Monozyten, gefärbt auf CD14+ (rot) und Amylin (grün) im Blut derselben Ratten wie in (b) (n = 5 Blutproben/Gruppe). e Interleukin (IL)-1β ELISA im Plasma von HIP vs. WT-Ratten ähnlich den Gruppen in (b) (n = 10 Männer/Gruppe). f Konfokale mikroskopische Bilder, die IL-1β- und Amylinablagerungen in Gehirnblutgefäßen bei in (b) untersuchten Ratten zeigen (n = 3 Männer/Gruppe). g IHC-Analyse von Gehirnschnitten von HIP- und WT-Ratten aus den gleichen Gruppen wie in (c), die vaskuläre Ablagerungen von Amylin (braun) und astrogliale Reaktionen (grüne Flecken für fibrilläres saures Glia-Protein; GFAP) zeigen (n = 5 Männer/Gruppe) . IHC-Analyse von phagozytischen Mikroglia (CD68) (h) und vaskulärer Monozytenrekrutierung (CD11b) (i) in Gehirnschnitten von HIP- vs. WT-Ratten aus denselben Gruppen wie in (b) (n = 10 Männer/Gruppe). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; ungepaarter t-Test für alle Panels.

Mithilfe der Durchflusszytometrie fanden wir im Blut von HIP-Ratten eine höhere Anzahl an CD14+-Monozyten und Amylin-positiven CD14+-Monozyten als im Blut von WT-Wurfgeschwistern (Abb. 2c). Wie im menschlichen Blut von Personen mit AD (Abb. 1f) weisen konfokale mikroskopische Aufnahmen zirkulierender Monozyten, die auf CD14+ gefärbt sind, auch Amylinablagerungen auf (Abb. 2d).

Pankreas-Amyloid-bildendes Amylin aktiviert das NLRP3-Inflammasom in Makrophagen und dendritischen Zellen, was zur Reifung von Interleukin (IL)-1β und einer Entzündung der Pankreasinseln führt11,12,13. Die Konzentration des proinflammatorischen Zytokins IL-1β im Plasma war bei HIP-Ratten höher als bei WT-Wurfgeschwistern (Abb. 2e). Dies war mit einer erhöhten IL-1β-Immunreaktivitätssignalintensität in den Blutgefäßwänden des Gehirns von HIP-Ratten verbunden (Abb. 2f), was mit zuvor veröffentlichten Daten aus der IL-1β-Analyse im Parenchymgewebe des Gehirns von HIP-Ratten übereinstimmt25,26. Unter Verwendung von IHC mit Anti-Amylin- und Anti-Glia-Fibrillar-Säure-Protein (GFAP)-Antikörpern konnten wir eine durch zerebrovaskuläres Amylin induzierte Astroglia-Reaktion im Gehirn von HIP-Ratten nachweisen (Abb. 2g). Dies scheint mit der vaskulären Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen zusammenzuhängen, wie von IHC mit Antikörpern gegen Cluster of Differentiation (CD) 68 und CD11b vorgeschlagen (Abb. 2h, i). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine chronische Exposition gegenüber amyloidbildendem Amylin, das aus der Bauchspeicheldrüse ausgeschieden wird, ein Auslöser systemischer und lokaler zerebrovaskulärer Entzündungen ist.

Die Fluoreszenzsignalintensität von Thioflavin T (ThT) in Blutlysaten war bei HIP-Ratten höher als bei WT-Wurfgeschwistern (Abb. 3a), was auf eine Anreicherung von Amyloid bildendem Amylin im Blut hinweist. Mittels ELISA fanden wir erhöhte Amylinkonzentrationen in Gehirn-Mikrogefäßlysaten von HIP-Ratten im Vergleich zu Gehirn-Mikrogefäßlysaten von WT-Wurfgeschwistern im Alter von 16 Monaten (Abb. 3b). Die gleichzeitige Färbung von Hirnschnitten von HIP- und WT-Ratten mit Anti-Aβ- und Anti-Amylin-Antikörpern ergab eine vaskuläre Amylin-Aβ-Ablagerung bei HIP-Ratten (Abb. 3c). In Gehirnen von HIP-Ratten wurde Amylin-Immunreaktivität auf der luminalen Seite des Blutgefäßes nachgewiesen, häufig mit Aβ in perivaskulären Räumen und verstreut im Parenchymgewebe.

a Fluoreszenzsignalintensitäten von Thioflavin T (Th T) in Blutlysaten von HIP-Ratten und WT-Wurfgeschwistern (Alter 15–16 Monate; n = 10 Männer/Gruppe). b Amylin-Konzentrationen in Mikrogefäßlysaten des Gehirns bei HIP- und WT-Ratten ähnlich denen in (a) (n = 10 Männer/Gruppe). c IHC-Analyse von HIP-Rattengehirnen, die Aβ-Ablagerungen (grün) in perivaskulären Räumen und eine Amylin-Ansammlung (braun) im Lumen zeigt. (n = 5 Männer/Gruppe; Alter 15–16 Monate). d Durchschnittliche Fluoreszenzsignalintensitäten von Thioflavin T (Th T) in Blutlysaten von APP/PS1/HIP- und APP/PS1-Wurfgeschwistern im Alter von 15–16 Monaten (n = 10 männliche Ratten/Gruppe). e Amylin-Konzentrationen in Mikrogefäßlysaten des Gehirns derselben Ratten wie oben. f Repräsentative IHC-Mikroaufnahmen von Gehirnschnitten von APP/PS1/HIP- und APP/PS1-Ratten, die gleichzeitig mit Anti-Amylin- (braun) und Anti-Aβ-Antikörpern (grün) gefärbt wurden (n = 5 Männer/Gruppe; Alter 15–16 Monate). ) (3 Folien/Gehirn). Repräsentative IHC-Bilder und Analyse von phagozytischen Mikroglia (CD68) (g) und vaskulärer Monozytenrekrutierung (CD11b) (h) in Gehirnschnitten von APP/PS1/HIP- und APP/PS1-Rattenmännchen (n = 10 Männchen/Gruppe; Alter 16– Monate). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; ungepaarter t-Test für alle Panels.

Wir verwendeten außerdem APP/PS1-Ratten mit pankreatischer Expression von menschlichem Amylin (APP/PS1/HIP-Ratten), um den Einfluss von pankreatischem Amyloid-bildendem menschlichem Amylin auf zerebrovaskuläres Aβ im Zusammenhang mit AD-ähnlichen Pathologien zu untersuchen. APP/PS1/HIP-Ratten entwickeln Amylin-Aβ-Ablagerungen im Gehirn21. Im Vergleich zu APP/PS1-Wurfgeschwistern weisen APP/PS1/HIP-Ratten eine erhöhte Th-T-Signalintensität in Blutlysaten (Abb. 3d) und eine Amylin-Akkumulation in Gehirnmikrogefäßen auf (Abb. 3e). IHC mit Anti-Aβ- (grün) und Anti-Amylin-Antikörpern (braun) zeigte vaskuläre Gewebebereiche mit Amylin-Aβ-Co-Lokalisierung in APP/PS1/HIP-Rattengehirnen, wohingegen APP/PS1-Wurfgeschwister keine zerebrovaskulären Amylin-Aβ-Ablagerungen aufwiesen (Abb . 3f). Dies hing mit der vaskulären Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen zusammen, wie durch IHC mit Antikörpern gegen CD68 und CD11b angezeigt (Abb. 3g, h), ähnlich der bei HIP-Ratten nachgewiesenen zerebrovaskulären Entzündung (Abb. 2h, i).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass das späte Auftreten neurologischer Defizite bei Ratten mit pankreasspezifischer Expression von menschlichem Amylin (ergänzende Abbildung 2) mit der Ablagerung von Amylin in zerebralen Arteriolen (einschließlich Co-Ablagerungen mit Aβ) verbunden ist (Abb. 3c, f). und in Kapillaren (Abb. 2b, e) und mit der Entwicklung systemischer und zerebrovaskulärer Entzündungen (Abb. 2 und 3g, h). Diese Ergebnisse spiegeln unsere Erkenntnisse beim Menschen wider (Abb. 1).

Eine beeinträchtigte interstitielle Flüssigkeitsdrainage im Gehirn wird durch das Vorhandensein perivaskulärer Aβ-Ablagerungen angezeigt (wie in Abb. 3c, f) und wird auf Veränderungen der Kontraktilität und Relaxation vaskulärer SMCs zurückgeführt2,3,4. Die endotheliale Stickoxid (NO)-Arginase-Homöostase, ein Mediator des vaskulären myogenen Tonus33, ist bei HIP-Ratten beeinträchtigt und mit einer endothelialen Dysfunktion verbunden34. Wir verwendeten Experimente zum zerebralen Blutfluss (CBF), Druckmyographie und vaskulärem SMC zum oxidativen Stress bei HIP- und WT-Ratten, um einen möglichen Zusammenhang zwischen erhöhten Konzentrationen von Amyloid-bildendem Amylin im Blut und einer Beeinträchtigung der zerebralen Vasodilatation zu testen.

Längsschnitt-MRT-Messungen des Gehirns zeigten konsistente strukturelle Veränderungen, die mit zunehmendem Alter bei HIP-Ratten im Vergleich zu WT-Ratten schneller voranschritten (Abb. 4a). Die zerebrale Perfusion wurde mittels pseudokontinuierlicher arterieller Spinmarkierung (ASL)35 beurteilt. Die Ergebnisse zeigen einen verringerten CBF bei HIP-Ratten im Alter von 15–16 Monaten (Abb. 4b). Die Plasmakonzentrationen von Nitrit und Nitrat (stabile NO-Endprodukte) waren bei HIP-Ratten im Vergleich zu WT-Ratten im Alter von 15–16 Monaten erhöht (Abb. 4c), möglicherweise als Folge einer systemischen Entzündung bei HIP-Ratten (wie aus den Daten in Abb. 2). Druckmyographieexperimente mit isolierten Pialarterien zeigen, dass sowohl die WT- als auch die HIP-Arterien einen Arterientonus entwickeln36 (z. B. druckinduzierte Verengung) (Abb. 4d); Arterien von HIP-Ratten zeigen jedoch im Vergleich zu WT-Ratten einen erhöhten Arterientonus mit steigendem intravaskulären Druck (z. B. 60–100 mmHg) (Abb. 4d, e). Um die Amylin-induzierte Beeinträchtigung des Arterientonus weiter zu verifizieren, verwendeten wir Hirnarterien, die aus WT-Ratten und Amylin-Knockout-Ratten (AKO) isoliert wurden, sowie von AKO-Ratten, denen Amyloid bildendes menschliches Amylin intravenös injiziert wurde, und zwar nach einem Schema, das die Intensität des Amylin-Immunreaktivitätssignals reproduziert gemessen in menschlichem Plasma18 (d. h. 60 µg/kg Körpergewicht; tägliche intravenöse Injektion über die Schwanzvene für 1 Woche). Der Arterientonus ist in den Hirnarterien von WT- und AKO-Ratten ähnlich (Abb. 4f); Allerdings war der Arterientonus in Arterien von Ratten erhöht, denen menschliches Amylin injiziert wurde (Abb. 4f). Diese Ergebnisse deuten auf eine direkte Wirkung von Amylin auf die Beeinträchtigung des Arterientonus hin. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen weisen vaskuläre SMCs von HIP-Ratten eine erhöhte Lipidperoxidation auf (Abb. 4g, h), die auch bei SMCs auftritt, die mit exogenem menschlichem Amylin inkubiert wurden (ergänzende Abb. S3a, b).

ein T2-gewichtetes MRT und longitudinale ventrikuläre Hyperintensitätsvolumina bei HIP- vs. WT-Ratten (n = 4–5 Männer/Gruppe). b CBF-Karten und globaler CBF bei HIP- und WT-Ratten im Alter von 15–16 Monaten (9 Männchen/Gruppe). c Querschnittskonzentrationen von Plasmanitrit und -nitrat bei HIP- und WT-Ratten (n = 6 Männer/Gruppe/Alter). Durchmesserspuren in Pialarterien von HIP- und WT-Rattenmännchen bei unterschiedlichen intravaskulären Drücken (d) und Arterientonus der Pialarterien (e), gemessen beim angegebenen intravaskulären Druck (2–3 Arterien/Ratte, n = 6–7 Männchen/Gruppe). , Alter 15–16 Monate). f Dasselbe wie in (e) in hinteren Hirnarterien von WT- und Amylin-Knockout-Ratten (AKO) und bei AKO-Ratten, denen intravenös menschliches Amylin injiziert wurde (n = 3 Männer/Gruppe, Alter 9–10 Monate). g, h Lipidperoxidation in Pialarterien-SMCs von WT- und diabetischen HIP-Rattenmännchen, gemessen mit Liperfluo (g; N = 62 SMC von 4 WT-Ratten und 70 Zellen von 4 HIP-Ratten) und C11-BODIPY581/591 (h; N = 87). SMC von 7 WT-Ratten und 68 Zellen von 4 HIP-Ratten). i Arginase-Aktivität und Arginase-1- und Arginase-2-Konzentrationen in HIP- vs. WT-Gehirn-Mikrogefäßlysaten (n = 7 Männer/Gruppe; Alter 15–16 Monate). j Vorgeschlagener Mechanismus: Chronisch erhöhte Konzentrationen von pankreatischem Amyloid bildendem Amylin im Blut verursachen oxidativen Stress in der Gefäßwand, der zu einer NO-Arginase-Dysregulation und einer Beeinträchtigung der SMC-Funktion und des myogenen Tonus führt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. Nichtparametrischer Mann-Whitney-Test für Panels (g, h), ungepaarter t-Test für die anderen Panels.

Eine erhöhte Lipidperoxidation trägt zu oxidativem Stress in der Gefäßwand bei, verringert die NO-Bioverfügbarkeit und verändert die gefäßerweiternde Funktion. Sowohl die Arginase-Aktivität als auch die Arginase-Expression waren in mikrovaskulären Lysaten des Gehirns von HIP-Ratten im Vergleich zu denen von WT-Wurfgeschwistern erhöht (Abb. 4i), was auf eine Arginase-NO-Dysregulation hindeutet (Abb. 4j; vorgeschlagener Mechanismus). Ein möglicher Einfluss einer erhöhten Blut-Amylin-Konzentration auf die zerebrovaskuläre Arginase-NO-Regulation wurde weiter in mikrovaskulären Lysaten des Gehirns von Ratten getestet, denen amyloidbildendes menschliches Amylin intravenös injiziert wurde (ergänzende Abbildung S3c).

Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass perivaskuläre Aβ-Ablagerungen bei HIP- und APP/PS1/HIP-Ratten (Abb. 3c, f) möglicherweise mit einer veränderten spontanen Kontraktion/Entspannung zerebrovaskulärer SMCs zusammenhängen, die durch die Entwicklung einer Amylin-Vaskulopathie verursacht wird.

Western-Blot-Analysen von Aβ in Hirngewebehomogenaten (Abb. 5a) und Western-Blot-Analysen von angereichertem Aβ durch Immunpräzipitation in Plasma- und Hirnhomogenaten (Abb. 5b) zeigen eine Aβ-Ablagerung im Gehirn bei HIP-Ratten, selbst wenn keine genetisch induzierte Aβ-Überexpression vorliegt (dh wie bei APP/PS1-Ratten). Das Verhältnis der Plasma-zu-Hirn-Aβ-Spiegel war bei HIP niedriger als bei WT-Ratten, was auf eine mögliche Beeinträchtigung des Aβ-Transports vom Gehirn ins Blut schließen lässt. In diesen Experimenten verwendeten wir Gehirnhomogenate einer 12 Monate alten APP/PS1-Ratte als Positivkontrollen für die Aβ-Akkumulation im Gehirn.

a Western-Blot-Analyse von Gehirngewebe-Aβ bei WT- und HIP-Ratten (n = 4–5 Männer/Gruppe; Alter 15–16 Monate) mit Ratten-Aβ40 und APP/PS1-Rattenhirnhomogenat als positive Kontrollen für das Aβ-Immunreaktivitätssignal. b Geschätzter Gehirn-Aβ-Ausfluss durch Immunpräzipitation und Western-Blot-Analysen von Aβ in Plasma und Gehirnhomogenaten von WT- und HIP-Ratten (ähnlich denen in a), wobei APP/PS1-Rattenhirnhomogenat als Positivkontrolle für das Aβ-Immunreaktivitätssignal verwendet wurde. c Vorgeschlagene Wirkung von Amylin auf den Aβ-Transport durch die Blut-Hirn-Schranke. d Konfokale Mikroskopie und STORM-Analyse von Amylin in Gehirnmikrogefäßen, isoliert aus HIP- (n = 47 Mikrogefäßen) und WT-Ratten (n = 21 Mikrogefäßen) (n = 3 Männer/Gruppe; Alter 15–16 Monate). Konfokalmikroskopische Analyse von Serienschnitten aus HIP-Rattengehirnen, gefärbt mit Thioflavin S (Thio S) oder Amylin (e) und mit dem Lipidperoxidationsmarker 4-HNE oder Amylin (f) (n = 3 Männchen ähnlich denen in d). Western-Blot-Analyse von P-gp (g) und LRP1 (h) in Mikrogefäßlysaten des Gehirns von HIP- und WT-Ratten (n = 5–7 Männer/Gruppe ähnlich denen in a) und in mit menschlichem Amylin inkubierten mikrovaskulären ECs des Gehirns. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM.

Der Aβ-Transport durch die BHS wird durch das Low-Density-Lipoprotein-Receptor-Related-Protein 1 (LRP1), einen Apolipoprotein-E-(APOE)-Rezeptor, vermittelt37,38,39. An der BHS bindet LRP1 Aβ auf der Gehirnseite des Endothels und erleichtert so die Aβ-Freisetzung in den systemischen Kreislauf (Abb. 5c). P-Glykoprotein 1 (P-gp; auch bekannt als Mitglied 1 der ATP-Bindungskassetten-Unterfamilie B; ABCB1), eine ATP-abhängige Effluxpumpe, vermittelt die Freisetzung von Aβ auf der Blutseite der Blut-Hirn-Schranke40,41. ApoA-I stabilisiert P-gp in Endothelzellen (ECs)42,43 und bindet bei HIP-Ratten an Amylin, wie wir in unserer vorherigen Studie18 beschrieben haben. Hier haben wir Assoziationen der zerebrovaskulären Amylinablagerung mit durch EC-Stress vermittelten Veränderungen der LRP1- und P-gp-Proteinexpression im Mikrogefäßsystem des Gehirns von HIP-Ratten gemessen. Konfokale Mikroskopie und Analyse von Amylinablagerungen mithilfe der hochauflösenden Bildgebung der Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) zeigten das Nebeneinander optischer Intensitätssignale von Amylin und Caveolin-1 (Abb. 5d) und bestätigten die Amylinablagerung in Gehirnkapillaren von HIP-Ratten (siehe Abb. 3b). ). Die Ablagerung von Amylin in Gehirnkapillaren hat biochemische Eigenschaften von Amyloid (Abb. 5e) und löst die Akkumulation des Lipidperoxidationsmarkers 4-Hydroxynonenal (4-HNE) aus (Abb. 5f), was den durch Amylin-Amyloid induzierten oxidativen Stress innerhalb der Blut-Hirn-Schranke zeigt. Dies war mit herunterregulierten P-gp- und LRP1-Proteinspiegeln verbunden, wie die Western-Blot-Analyse dieser Proteine ​​in Hirnkapillarlysaten von HIP- und WT-Ratten und in Lysaten von ECs, die mit amyloidbildendem menschlichem Amylin inkubiert wurden, zeigte (Abb. 5g, h). .

Um festzustellen, ob Amyloid-bildendes Amylin den durch LRP1 vermittelten Aβ-Ausfluss direkt beeinflussen kann, verwendeten wir ein In-vitro-Modell der BHS, bei dem die EC-Monoschicht auf der luminalen Seite Amyloid-bildendem menschlichem Amylin und auf der abluminalen Seite (Gehirnseite) Aβ ausgesetzt wurde ), wie in Abb. 6a dargestellt. Das BBB-Modell wurde durch Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) auf Monoschichtbildung getestet (Abb. 6b). Alle Experimente wurden mit einer vollständig ausgebildeten EC-Monoschicht durchgeführt, die durch den maximalen TEER = 110 ± 5 Ω/cm2 gekennzeichnet war. Die Dosisreaktion von mikrovaskulären ECs des Gehirns auf die 24-stündige Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von menschlichem Amylin ist in Abb. 6c dargestellt. Die LRP1-Proteinspiegel nahmen mit steigenden Konzentrationen an menschlichem Amylin ab; Die LRP1-Expression war in ECs, die mit 10 µM menschlichem Amylin inkubiert wurden, um mehr als 50 % reduziert (Abb. 6c). Die Lebensfähigkeit der EC wurde durch die Inkubation mit menschlichem Amylin nicht beeinträchtigt (Abb. 6d), was darauf hindeutet, dass die verminderte LRP1-Proteinexpression nicht auf Zelltod zurückzuführen ist. Als nächstes trugen wir 24 Stunden lang menschliches Amylinpeptid (10 μM) oder Vehikel auf die luminale Seite (Blutseite) auf, gefolgt vom Waschen der EC-Monoschichten mit PBS und der Anwendung von FITC-Dextran oder Carboxyfluorescein-markiertem Aβ42 (Aβ42-FAM) auf der abluminalen Seite (Gehirn). ) Seite der BBB für 1 Stunde. Die Mengen an Aβ42-FAM und FITC-Dextran, die die Monoschicht durchquerten, wurden aus der Fluoreszenzintensität in den von der Lumenseite entnommenen Medienproben geschätzt und zur Berechnung des Aβ-Transzytosequotienten verwendet. Die Amylin-Vorbehandlung reduzierte den Aβ-Transzytosequotienten um 20 ± 5 % (P < 0,05) (Abb. 6e).

eine Cartoon-Darstellung des In-vitro-BBB-Modells (ECs-Monoschicht – Lumenkammer; Astrozyten – Abluminalkammer), das in Aβ-Transzytoseexperimenten verwendet wird. b Transendothelialer elektrischer Widerstand (TEER) in EC-Monoschichten (n = 20 Präparate) als Funktion der Tage in Kultur. c Repräsentative Western Blot- und Densitometrie-Quantifizierung von LRP1 in Lysaten aus primären mikrovaskulären vaskulären ECs des Rattenhirns, die 24 Stunden lang mit Vehikel oder verschiedenen Konzentrationen von menschlichem Amylin (500 nM, 1 µM, 5 µM und 10 µM) behandelt wurden (n = 3 Präparationen/ prüfen). d Prozentuale Zelllebensfähigkeit aus dem MTS-Assay in ECs, die 24 Stunden lang mit amyloidbildendem menschlichem Amylin (500 nM, 1 µM, 5 µM und 10 µM) oder Vehikel behandelt wurden. e Der Aβ42-Transzytosequotient (TQ) über die In-vitro-BBB in mit Vehikel und menschlichem Amylin behandelten EC-Monoschichten. f LRP1-mRNA-Spiegel (fache Differenz unter Verwendung der 2−ΔΔCt-Methode), gemessen mit qRT-PCR in Lysaten von ECs, die mit Vehikel, menschlichem Amylin oder Ratten-Amylin behandelt wurden. g LRP1-mRNA-Spiegel, gemessen durch qRT-PCR in Gehirnkapillarlysaten derselben Ratten wie in Abb. 5h. h, i miRNA (miR)-103- und miR-107-Expressionsniveaus, gemessen durch qRT-PCR in Lysaten von ECs, die mit Vehikel oder menschlichem Amylin behandelt wurden (wie in Abb. 5h), und in Gehirnkapillarlysaten von denselben Ratten wie in Abb . 5h. j TargetScan-Schema, das Konsensregionen für miR-205, miR200bc-3p/429 sowie miR-103 und miR-107 zeigt. Western-Blot-Analysen von LRP1 aus mit miRNA (miR) 103 und miR-107 behandelten ECs im Vergleich zur miR-Kontrolle (n = 3 Präparate/Gruppe) (k) sowie von LRP1 (l) und P-gp (m) aus Mit Antagomir (amiR) 103 und amiR-107 behandelte ECs im Vergleich zu mit amiR-Kontrolle behandelten Zellen (n = 3 Präparate/Gruppe). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM. einfaktorielle ANOVA mit Dunnetts Post-Hoc (F). ungepaarter T-Test für die anderen Panels.

In ECs, die 24 Stunden lang mit 10 µM amyloidbildendem menschlichem Amylin inkubiert wurden, waren die LRP1-mRNA-Spiegel im Vergleich zu Kontroll-ECs (mit Vehikel behandelt) und ECs, die mit der gleichen Konzentration an Ratten-Amylin inkubiert wurden, erhöht (Abb. 6f). Die LRP1-mRNA-Spiegel waren in HIP-Gehirnkapillarlysaten im Vergleich zu WT-Gehirnkapillarlysaten erhöht (Abb. 6g). Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass amyloidbildendes Amylin den Aβ-Ausfluss direkt beeinflussen kann, indem es die Transportproteinexpression auf posttranskriptioneller Ebene unterdrückt.

Veröffentlichte Daten zeigen, dass die Paralog-miRNAs miR-103 und miR-107 durch oxidativen Stress hochreguliert werden44 und die LRP1-Translation in mehreren Zelllinien45 unterdrücken. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass miR-103 und miR-107 an der Amylin-induzierten Herunterregulierung von LRP1 in den mikrovaskulären ECs beteiligt sind. ECs, die 24 Stunden lang mit 10 µM amyloidbildendem menschlichem Amylin inkubiert wurden, zeigten erhöhte miR-103- und miR-107-Spiegel, wie aus den RT-PCR-Daten von EC-Lysaten hervorgeht (Abb. 6h). Unter Verwendung der gleichen Kapillarlysate von HIP- und WT-Ratten wie oben (Abb. 6g) stellten wir höhere miR-103- und miR-107-Spiegel in HIP-Kapillaren im Vergleich zu WT-Rattenkapillaren fest (Abb. 6i), was mit den In-vitro-Ergebnissen übereinstimmt (Abb . 6h). TargetScan sagt voraus, dass miR-103 und miR-107 direkt an LRP1 binden (Abb. 6j). Daher haben wir miR-103- und miR-107-Mimetika in mikrovaskuläre ECs co-transfiziert und dann Antagomir (amiR)-103 und amiR-107 verwendet, um die Amylin-induzierte Hochregulierung von miR-103 und miR-107 zum Schweigen zu bringen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass miR-103/107 LRP1 herunterreguliert (Abb. 6k) und den Effekt der Inkubation mit amyloidbildendem menschlichem Amylin reproduziert (Abb. 5h). AmiR-103/107 rettet die LRP1-Expression in ECs nach Amylin-induziertem Zellstress (Co-Inkubation mit 10 μM menschlichem Amylin) (Abb. 6l); amiR-103/107 rettet jedoch nicht die P-gp-Expression (Abb. 6m).

Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse (Abb. 2–6) auf einen möglichen Zusammenhang zwischen chronisch fehlreguliertem Pankreas-Amylin und beeinträchtigtem Aβ-Ausfluss von Ratten aus dem Gehirn in den systemischen Kreislauf hin, und zwar über folgende Mechanismen: 1. Amylin-Vaskulopathie, die zu einer verringerten zerebralen Vasodilatation und veränderten interstitiellen Veränderungen führt Flüssigkeitsabfluss entlang der Wände der Gehirnblutgefäße; und 2, Amylin-induzierte endotheliale Dysfunktion, die zu einer Herunterregulierung von P-gp und LRP1 an der BHS führt. Bei HIP-Ratten könnten andere Ursachen als ein verringerter Transport, wie veränderte Abbauraten von Aβ, eine erhöhte Aggregation, die eine immunologische Verdeckung von Aβ verursacht, ein verstärkter Zustrom von Aβ oder erhöhte Aβ-Blutspiegel, die Abnahme des Plasma-zu-Hirn-Verhältnisses für Aβ erklären .

Frühere Studien mit einem TaqMan-Genexpressionstest ergaben, dass sowohl entzündungsfördernde als auch entzündungshemmende Mikroglia-Gene in HIP- und WT-Rattengruppen unterschiedlich exprimiert wurden25. Um mögliche umfangreiche molekulare Muster in Gehirngenen vorherzusagen, die mit einer chronischen Exposition gegenüber Pankreas-Amyloid bildendem menschlichem Amylin im Blut verbunden sind, verwendeten wir RNA-Seq- und Genexpressionsnetzwerkanalysen von Hippocampus-Genen bei männlichen HIP- und WT-Ratten (Alter 15–16 Jahre). -Monate). Der Vergleich der RNAseq-Daten von HIP- und WT-Ratten (n = 10 Männchen/Gruppe) ermöglichte die Identifizierung von 408 Gentranskripten, die unterschiedlich exprimiert wurden (P < 0,05). Der Bereich des charakteristischen Ausmaßes der Veränderung hochregulierter und herunterregulierter DE-Gene ist in Abb. 7a dargestellt. DE-Gene wurden in der Ingenuity Pathway Analysis (IPA)-Datenbank mit Anmerkungen versehen, die die Anreicherung mehrerer kanonischer Pfade identifizierten, die durch diese Gene dargestellt werden (Abb. 7b). Unter den DE-Genen bei HIP-Ratten im Vergleich zu WT-Ratten identifizierten 25 Gene die Anreicherung der fünf wichtigsten kanonischen Signalwege, wie aus der hierarchischen Cluster-Heatmap dieser DE-Gene hervorgeht (Abb. 7c). Wir haben die 408 DE-Gene basierend auf der Genontologie (GO) mithilfe der Datenbank für Annotation, Visualisierung und integrierte Entdeckung (DAVID) weiter in biologische Prozesse kategorisiert, die im Vergleich zu WT-Ratten mit HIP angereichert sind (Abb. 7d). Diese Ergebnisse (Abb. 7b–d) deuten darauf hin, dass eine Fehlregulation von Genen, die an zellulären Reaktionen auf Entzündungen, veränderten Stoffwechsel und Hypoxie beteiligt sind, mit chronisch erhöhten Amylinkonzentrationen im Blut, zerebrovaskulären Amylinablagerungen und einer Beeinträchtigung der Aβ-Clearance im Gehirn verbunden sein könnte.

a Der Log10-Wert (p-Wert) im Vergleich zu Log10 (facher Wechsel) der DE-Gene im Gehirn von HIP- und WT-Ratten. Jeder Punkt stellt ein Gen dar, mit hochregulierter roter Farbe (HIP vs. WT, ≥ 1,5-fache Änderung), herunterregulierter blauer Farbe (HIP vs. WT, ≥ 1,5-fache Änderung) und < 1,5-facher Änderung in schwarzer Farbe . b Die fünf wichtigsten kanonischen Pfade, die durch Ingenuity Pathways Analysis von differentiell exprimierten (DE) Genen identifiziert wurden, die durch RNA-Seq-Analyse von Hippocampusgewebe aus den HIP- und WT-Rattengruppen nachgewiesen wurden (P < 0,05) (n = 10 Männer/Gruppe). c Die hierarchische Clusterung von 25 DE-Genen identifizierte die Anreicherung der fünf wichtigsten kanonischen Signalwege in (b). d Top 5 der biologischen Prozesse der Genontologie (GO), angereichert in der HIP-Rattengruppe im Vergleich zur WT-Rattengruppe.

Unsere Daten von Menschen und Labortiermodellen zeigen, dass ein potenziell kritischer Mechanismus, der die Entwicklung einer zerebralen Aβ-Pathologie ermöglicht, die zerebrovaskuläre Ansammlung von amyloidbildendem Amylin, das aus der Bauchspeicheldrüse ausgeschieden wird, beinhaltet. Da Pankreas-Amylin zur Entwicklung von Typ-2-DM beiträgt, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Amylin-Aβ-Wechselwirkung ein potenziell fehlender molekularer Zusammenhang zwischen Typ-2-DM und AD und ein vielversprechender neuer Therapieansatz ist. Wir fanden drei voneinander abhängige Faktoren, die einer Amylin-induzierten Beeinträchtigung der Aβ-Clearance im Gehirn zugrunde zu liegen scheinen: 1. Die Amylinkonzentration im Blut ist bei Demenz-Patienten im Vergleich zu kognitiv nicht beeinträchtigten Personen erhöht. 2, chronisch erhöhte Konzentrationen von Amyloid-bildendem Amylin im Blut fördern die Amylin-Akkumulation in zirkulierenden Monozyten, was eine systemische Entzündung widerspiegelt und zu einer zerebrovaskulären Amylin-Ablagerung führt; und 3: Die zerebrovaskuläre Amylinablagerung stört den LRP1-Pgp-vermittelten Aβ-Transport über die BHS und die Aβ-Clearance durch interstitielle Flüssigkeitsdrainage entlang der Gefäßwände, was durch die Co-Lokalisierung von Amylin-Aβ in Blutgefäßwänden und perivaskulären Räumen angezeigt wird.

Die kompensatorische Insulinsekretion ist für die Insulinresistenz von zentraler Bedeutung und geht mit einer erhöhten Amylinsekretion einher8,9,10 (was auch durch unsere aktuellen Daten bei Teilnehmern einer Kohorte belegt wird, die das kognitive Kontinuum von kognitiv unbeeinträchtigt bis hin zu leichter kognitiver Beeinträchtigung und Demenz abdeckt; Abb. 1d). Da Patienten mit Typ-2-DM viele Jahre vor ihrer klinischen Diagnose eine Insulinresistenz aufweisen, sind sie einer chronischen Hyperamylinämie ausgesetzt, die mit der Ablagerung von Amylin-Amyloid in der Bauchspeicheldrüse8,9,10, der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms und einer erhöhten Sekretion von proinflammatorischem IL verbunden ist. 1β aus Makrophagen und dendritischen Zellen11,12,13. Unsere Daten, die zeigen, dass Amylin von zirkulierenden Monozyten in Verbindung mit erhöhten IL-1β-Plasmakonzentrationen verschlungen wird, deuten auf mögliche angeborene Immunreaktionen auf erhöhte Konzentrationen von pankreatischem Amyloid-bildendem Amylin im Blut hin. Diese Daten deuten darauf hin, dass sich eine zerebrovaskuläre Amylinablagerung, die zu einer perivaskulären Entzündung führt, zumindest teilweise aufgrund einer unzureichenden angeborenen Immunreaktion auf prädiabetesbedingte steigende Konzentrationen von pankreatischem Amyloid im Blut entwickeln kann. Zukünftige Studien sollten klären, ob die Modulation des Amylin-IL-1β-Signalwegs einen Ansatz zur Bekämpfung von Neuroinflammation bei AD darstellen könnte.

Perivaskuläre Aβ-Ablagerungen sind in AD-Gehirnen häufig und werden auf eine beeinträchtigte interstitielle Flüssigkeitsableitung zurückgeführt2,3,4. Die treibende Kraft der interstitiellen Flüssigkeitsdrainage entsteht durch die spontane Kontraktion und Entspannung der glatten Gefäßmuskelzellen2,3,4. Unsere Ergebnisse zeigen Zusammenhänge zwischen Amylin-vermittelter systemischer Entzündung und verringerter zerebraler Vasodilatation und CBF durch Arginase-NO-Dysregulation innerhalb der Gefäßwand. Unsere Daten zeigen auch, dass sich pankreas-amyloidbildendes Amylin in Gehirnkapillaren ansammelt und die Expression von P-gp und LRP1 beeinflussen kann, Proteinen, die den Aβ-Transport über die BHS vermitteln. Obwohl APOE/LRP1-regulierte Wege eine gut etablierte Rolle bei der Aβ-Clearance im Gehirn spielen46, könnte die Möglichkeit, dass die LRP1-Expression durch Amylin von der luminalen Seite des Blutgefäßes herunterreguliert werden kann, ein neues therapeutisches Ziel zur Reduzierung der AD-Pathologie darstellen.

Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass ein Screening auf eine Amylin-Dysregulation der Bauchspeicheldrüse durch Messung der Amylin-Anreicherung im Blut und in zirkulierenden Monozyten Personen identifizieren könnte, bei denen ein erhöhtes Risiko für mikrovaskuläre Erkrankungen des Gehirns und Alzheimer-Erkrankungen besteht. Dies ist auch deshalb wichtig, weil eine Beeinträchtigung der exekutiven Funktion und des Arbeitsgedächtnisses bei Menschen mit Typ-2-Diabetes ohne Demenz häufig vorkommt1 und eine Amylin-Dysregulation mit Typ-2-Diabetes in Zusammenhang steht und möglicherweise ein Faktor ist, der zu diesen klinischen Auswirkungen beiträgt. Typ-2-DM und AD, zwei wachsende globale Gesundheitsbedrohungen, scheinen durch komplexe Mechanismen miteinander verbunden zu sein14,47,48,49,50, an denen möglicherweise Amyloid-bildendes Amylin als molekularer Faktor beteiligt ist, der über die Dysregulation von Glukose und Insulin hinausgeht. Amylin-vermittelte zerebrovaskuläre Entzündungen, eine Beeinträchtigung der Aβ-Clearance im Gehirn und eine gestörte Genexpression im Gehirn erscheinen als biologische Merkmale der pankreatischen Hypersekretion von Amylin (Prädiabetes). Die vorliegenden Daten können das Verständnis der Mechanismen zerebrovaskulärer Entzündungen und des Risikos einer beeinträchtigten Aβ-Ausscheidung aus dem Gehirn bei prädiabetischer Insulinresistenz verbessern, wenn die Amylinkonzentration im Blut chronisch erhöht ist. Die Hemmung systemischer und zerebrovaskulärer Entzündungen, die durch pankreas-amyloidbildendes Amylin verursacht werden, könnte die zerebrovaskuläre Arginase-NO-Dysregulation, Vasokonstriktion, Durchblutungsstörungen und Aβ-Akkumulation im Gehirn reduzieren.

Bei dieser Forschung wurden anonymisiertes Vollblut, Plasma sowie gefrorenes und formalinfixiertes Hirngewebe aus der Biobank des Alzheimer’s Disease Research Center an der University of Kentucky (UK-ADRC) gemäß einem vom University of Kentucky Institutional Review Board genehmigten Protokoll verwendet ( IRB). Die Einverständniserklärung wurde prospektiv eingeholt. Vollblutproben wurden von 83 Teilnehmern einer Kohorte entnommen, die das kognitive Kontinuum von kognitiv unbeeinträchtigt bis hin zu leichter kognitiver Beeinträchtigung und Demenz abdeckte, und 80 Proben wurden analysiert (alle im selben Amylin-ELISA-Kit enthalten). Die Messungen wurden doppelt durchgeführt. Von 42 Personen mit Demenz vom sAD-Typ, dokumentiert durch Amyloid-β (Aβ)-Positivität, und von 18 kognitiv nicht beeinträchtigten Personen wurden gefrorene Schläfenkortex-Gewebeproben entnommen. Von 20 Personen wurden sowohl Plasma als auch gefrorenes Gehirngewebe gewonnen. Formalin-fixierter dorsolateraler Frontalkortex (Brodmann-Bereich 9) wurde von 32 Personen erhalten. Zusammenfassende Statistiken für Personen, die jeden Gewebetyp bereitstellen, einschließlich Probengröße, kognitivem Status, Geschlecht, Diabetesstatus und Alter, zusammen mit klinischen und neuropathologischen Informationen, sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Das Fehlen/Vorhandensein von Diabetes wurde im Laufe des Lebens (bei klinischen Längsschnittbesuchen) anhand der Selbstauskunft des Patienten oder des Pflegepersonals und der Einnahme von Diabetikermedikamenten festgestellt. Die Beurteilung der klinischen Demenz und der neuropathologischen Merkmale, einschließlich neuritischer Amyloid-Plaques, des Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD), des Braak-NFT-Stadiums und des Schweregrads der zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA), wurden gemäß veröffentlichten Protokollen bewertet27,28,29 ,30,31. Eine sekundäre IHC-Analyse der zerebrovaskulären Amylin-Aβ-Ablagerung wurde in einer Untergruppe von fAD-Gehirnen (n = 27) mit dokumentierter Amylin-Akkumulation durch IHC und ELISA durchgeführt21. Formalin-fixierte temporale Kortexgewebe von fAD-Mutationsträgern wurden von der Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders am UCL Queen Square Institute of Neurology (Vereinigtes Königreich) und dem King's College London (Vereinigtes Königreich) bereitgestellt.

An allen menschlichen Gewebeproben wurden Beobachter-Blindanalysen durchgeführt; Die Ergebnisse wurden dem AD Center an der Universität von Kentucky übermittelt, um die Zusammenhänge mit der AD-Pathologie/kognitiven Funktion zu bewerten. Um Verzerrungen vorzubeugen, wurden die Forscher auch bei der Bewertung der histologischen Analysen und bei den Längsschnitttests zum Verhalten der Tiere verblindet. Die Forscher waren während der pharmakologischen Intervention/Injektion nicht verblindet, da die Interventionen von demselben Personal durchgeführt wurden. Bei den meisten biochemischen Tests wurden die Forscher nicht geblendet, da dies nicht notwendig ist. Die Datenerfassung wurde gleichzeitig für Versuchsgruppen mit derselben Einstellung durchgeführt.

Diese Untersuchung entspricht dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von der US National Academies Press (8. Auflage, 2011) und wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Kentucky genehmigt. Die Ratten wurden in einzeln belüfteten Käfigen mit einem 12-stündigen Lichtzyklus gehalten und erhielten eine Standard-Pelletnahrung und Wasser nach Belieben.

Wir verglichen Ratten, die Typ-2-Diabetes entwickeln, der mit der Expression von amyloidbildendem menschlichem Amylin in der Bauchspeicheldrüse verbunden ist (männliche HIP-Ratten; n = 84), mit Kontroll-Wildtyp-Ratten, die endogenes, nicht amyloidogenes Ratten-Amylin in der Bauchspeicheldrüse exprimieren (WT-Ratten). ; n = 52). Zuchtpaare wurden vom Charles River Laboratory gekauft. Für Querschnittsblut-Amylin- und Glukoseanalysen verwendeten wir HIP-Ratten im Alter von 6–8 Monaten, 10–12 Monaten und 15–16 Monaten. Für alle anderen Experimente verwendeten wir Ratten im Alter von 15–16 Monaten. Wir verwendeten außerdem APP/PS1/HIP-Ratten (n = 10 Männer; Alter 15–16 Monate), um den Einfluss von Pankreas-Amyloid-bildendem menschlichem Amylin auf zerebrovaskuläres Aβ im Zusammenhang mit AD-ähnlichen Pathologien zu untersuchen. APP/PS1/HIP-Ratten wurden wie zuvor beschrieben erzeugt21. Kurz gesagt, TgF344-19-Ratten vom Rat Resource and Research Center, Univ. aus Missouri, Columbia, MO (APP/PS1-Ratten) sind Fischer-Ratten, die das menschliche Aβ (A4)-Vorläuferprotein (hAPP)-Gen mit der schwedischen Mutation (K595N/M596L) und das Presenilin-1-Gen (PSEN1) mit einer Exon-Deletion exprimieren 9, gesteuert durch Maus-Prion-Promotor (Prp). Die APP/PS1-Ratten wurden mit HIP-Ratten gekreuzt, um Ratten zu erzeugen, die dreifach transgen für menschliches Amylin, APP und PSEN1 sind (APP/PS1/HIP-Ratten). APP/PS1-Ratten (n = 10 Männer; Alter 15–16 Monate), die nicht-amyloidogenes Ratten-Amylin exprimieren, dienten als Kontrollen für die amyloidogenen Wirkungen von menschlichem Amylin. Wir verwendeten auch Bauchspeicheldrüsen- und Gehirngewebe von Amylin-Knockout-Ratten (AKO)21 (n = 3 Männer; Alter 15–16 Monate) als Negativkontrollen für die Amylin-Expression. In der Studie wurden insgesamt n = 159 männliche Ratten verwendet.

MRT-Scans wurden an HIP- und WT-Wurfgeschwistern mit einem horizontalen 7-T-Kern-MRT-Scanner (ClinScan, Brucker BioSpin MRI, Ettlingen, Deutschland) durchgeführt18. Koronale T2-gewichtete Bilder wurden unter Verwendung allgemeiner Parameter erhalten: Sichtfeld (FOV) 40 mm, Wiederholungszeit (TR) 3000 ms, Echozeit (TE) 24 ms, Schichtdicke 1 mm, Abstand zwischen den Schichten 1 mm, 7 Schichten . Die zerebrale Perfusion wurde mithilfe des veröffentlichten ASL-Protokolls35 beurteilt. Die anatomischen und Perfusionsbilder wurden mit den ASL-Toolbox-Routinen gemeinsam registriert und gefiltert. Für jede Ratte wurde manuell eine Maske definiert, um beide Gewebe von außerhalb des Gehirns auszuschließen, da die Schwellenwerte manchmal nicht ausreichten, um diese Gewebe auszuschließen. Es wurde auch festgestellt, dass Pixel am Rand des Gehirns große Schwankungen in den Perfusionswerten hervorriefen – vermutlich aufgrund von Teilvolumen- und Suszeptibilitätseffekten – und daher ebenfalls ausgeschlossen wurden. Um Verzerrungen zu vermeiden, wurden die Perfusionswerte ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit der Ratten bestimmt.

Die Defizite der Vorderbeine der Ratte wurden anhand der Kontaktzeit der Vorderbeine mit der Wand im Zylindertest bewertet. Die Balancefähigkeit der Ratte wurde bestimmt, indem der Winkel aufgezeichnet wurde, in dem das Tier auf einer ansteigenden schiefen Ebene auszurutschen begann. Anomalien in den Hinterbeinen der Ratte wurden durch Bewertung der Schwere des Umklammerns der Hinterbeine beurteilt. Für den Rotarod-Test wurden die Tiere zwei Tage vor dem Test an den statischen Stab gewöhnt. Am Testtag wurde die Drehzahl des Rotarods innerhalb von 2 Minuten von 0 auf 40 U/min erhöht. Jede Ratte wurde auf dem Rotarod für insgesamt 4 Versuche pro Tag an 5 aufeinanderfolgenden Tagen getestet. Für jeden Trainingstag wurde der kleinste Wert der Falllatenz für jede Ratte verworfen. Die verbleibenden Messwerte wurden gemittelt und ein Gruppendurchschnitt für die HIP- und WT-Gruppen berechnet. Für die Analysen wurde die zusammengesetzte Z-Score-Methode verwendet21. Für jeden Verhaltenstest wurden Mittelwert und Standardabweichung aus einzelnen Variablen berechnet, die aus Längsschnittbewertungen von Tieren in den Versuchsgruppen gesammelt wurden. Der Z-Score für jedes Tier in jedem Verhaltenstest wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Der zusammengesetzte Score für jedes Tier wurde durch Mittelung der Z-Scores aus jedem Test berechnet.

Für die Immunhistochemie wurden formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Hirngewebe von Menschen und Ratten unter Verwendung veröffentlichter Protokolle15,18,21,25,26,34 verarbeitet. Kurz gesagt, Gewebeschnitte wurden dreimal 5 Minuten lang in Xylol entparaffiniert. Die Schnitte wurden zweimal in Reihenverdünnungen (100 %, 95 und 70 %) Alkohol rehydriert und einmal in PBS gewaschen. Die Schnitte wurden in 3 % H2O2 (verdünnt in Methanol) 30 Minuten lang bei RT inkubiert, um die interne endogene Peroxidase zu blockieren. Die Schnitte wurden dann zur Antigengewinnung 30 Minuten lang bei 95 °C in einem Dampfgarer in 1 × Retrieval-Puffer (S1699; Dako) inkubiert. Die Schnitte wurden auf RT abgekühlt und einmal in 1× PBS gewaschen. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang in einer Lösung aus 15 % Pferdeserum blockiert und einmal in PBS gewaschen. Die Schnitte wurden 24 Stunden lang mit Amylin-Antikörper inkubiert. Am zweiten Tag wurden alle Schnitte zweimal in 1× TBS gewaschen. Alle Schnitte wurden 1 Stunde lang mit biotinyliertem IgG-Sekundärantikörper inkubiert. Alle Schnitte wurden erneut gewaschen und 30 Minuten mit ABC-Komplex inkubiert. Alle Schnitte wurden gewaschen und in AEC-Chromogen entwickelt. Die Schnitte wurden gewaschen und 1 Stunde lang in 10 % NGS blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht mit dem zweiten Primärantikörper inkubiert. Am dritten Tag wurden alle Schnitte gewaschen und 1 Stunde lang mit AP-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert. Alle Schnitte wurden gewaschen und in Stay-Green-Chromogen entwickelt. Alle Schnitte wurden gewaschen und mit Hämatoxylin gegengefärbt und in Eindeckmedium auf Wasserbasis montiert. Antikörper gegen Amylin (1:200; T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories), GFAP (1:400; 3670S, Cell Signaling Technology), CD68 (1:200; MCA341GA, Biorad), CD11b (1:200; MCA275GA , Biorad) und Aβ (1:400; Klon 6E10, 803002, Biolegend) waren die primären Antikörper. Biotinyliertes IMPRESS-Pferd-Anti-Maus-AP-konjugiertes IgG (1:100, A3562, Sigma) und biotinyliertes Anti-Kaninchen-IgG (1:300, BA-1100, Vector) waren die Sekundärantikörper. Die Spezifität des Amylin-Antikörpers sowohl im Gehirngewebe von Menschen als auch von Ratten wurde in früheren Studien nachgewiesen15,18,21,25,26,34. Pankreasgewebe von AKO-Ratten war die Negativkontrolle für Amylin.

In Immunfluoreszenzexperimenten verwendeten wir formalinfixiertes, in Paraffin eingebettetes menschliches Gehirngewebe, das nach veröffentlichten Protokollen verarbeitet wurde18,21. Kurz gesagt, Gewebeschnitte wurden in Xylol entparaffiniert (dreimal, jeweils 10 Minuten), in serieller Alkoholverdünnung (100 %, 95 %, 85 %) rehydratisiert und einmal in 1 × PBS gewaschen. Die Antigengewinnung erfolgte in Citratpuffer (1x, S1699; Dako) (30 Minuten lang auf 90 °C erhitzt). Die Schnitte wurden 1 Stunde lang bei RT in Blockierungspuffer (5 % NGS, 2 % BSA und 0,25 % Triton-X in 1 × TBS) blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Schnitte 24 Stunden lang bei 4 °C in einer Primärantikörpermischung inkubiert. Die Schnitte wurden in 1x Tris-NaCl-Lösung gewaschen (dreimal, jeweils 5 Minuten). Die Schnitte wurden in einer Sekundärantikörpermischung eine Stunde lang bei RT inkubiert. Die Schnitte wurden wie zuvor in Tri-NaCl gewaschen und 5 Minuten lang in 0,2 % Sudanschwarz inkubiert, um die Autoimmunfluoreszenz zu blockieren. Die Schnitte wurden dreimal in 1×PBS gewaschen und in Eindeckmedium eingelegt. Die Schnitte wurden nach 24-stündiger Montage abgebildet. Anti-Amylin (1:200; Klon E5; SC-377530; Santa Cruz und 1:200; und T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories), Aβ (1:400; Klon 6E10, 803002, Biolegend), IL- 1β (1:400; ab9722, Abcam), Anti-Kollagen IV (1:500; ab6586; Abcam), Anti-Alpha-Glattmuskel-Actin-Alexa Fluor 405 (1:200; ab210128, Abcam), Anti-Caveolin-1 (1:100; sc-894; Santa Cruz, TX), Anti-LRP1 (1:500; sc-57351; Santa Cruz), Anti-4HNE (1:200; ab46545; abcam) waren die primären Antikörper. Sekundärantikörper waren: Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-IgG (A11034; Thermo Fisher), Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (1:300; A11029; Invitrogen), Alexa Fluor 568-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG (1:200; A11036). ; Invitrogen) und Alexa Fluor 568 konjugiertes Anti-Maus-IgG (1:300; A11004; Invitrogen). Die Kerne wurden mit DAPI-Eindeckmedium gegengefärbt. Für die Dreifachfärbung von menschlichem Gehirngewebe wurde nach der Färbung auf menschliches Amylin und Kollagen IV der Antikörper Actin-Alexa Fluor 405 der glatten Muskulatur hinzugefügt und DAPI-freies Eindeckmedium verwendet. Für die Thioflavin-S-Färbung wurden Gehirnschnitte nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,5 % Thioflavin S inkubiert. Die Objektträger wurden dann 3 Minuten lang in 70 % Ethanol und 5 Minuten lang in 0,2 % Sudanschwarz inkubiert, bevor sie gewaschen und montiert wurden.

Für IHC-Analysen wurden die Immunreaktivitätsintensitätssignale für jeden Antikörper (Amylin, Aβ) mithilfe des Color Deconvolution-Plugins in ImageJ entfaltet und analysiert. Die Vektorbestimmung (RGB-Profil) und der Schwellenwert wurden für jede interessierende Farbe anhand von Bildern der einzelnen Färbung (dh der Positivkontrolle für jeden getesteten Antikörper) ermittelt. Der Schwellenwert in jedem Bild wurde so eingestellt, dass der Hintergrund optisch minimiert wird. Das festgelegte RGB-Profil und der Schwellenwert wurden auf einen Makroskriptbefehl angewendet. Der Makroscript-Befehl wurde auf die Versuchsgruppen angewendet und der Prozentsatz der Fläche, die für die interessierende Farbe positiv war, wurde gemessen. Für die geschätzte zerebrovaskuläre Amylin-Aβ-Ablagerung wurden klar definierte Blutgefäße gezählt, die positiv für Amylin, Aβ oder beides waren. Die Anzahl der Blutgefäße wurde auf den gesamten Bildbereich normalisiert.

Frisch isolierte Gehirnkapillaren wurden für den STORM mit primären Antikörpern (Anti-Human-Amylin; T-4157; Peninsula Laboratories und Anti-Glycophorin A; sc-71159 Santa Cruz Biotech) und sekundären Antikörpern (Kaninchen-IgG-atto 647 und Maus-IgG-) gefärbt. atto 488) wie folgt: 35-mm-Schalen mit Glasboden (P35G-0.170-14-C, MatTek Corporation) wurden 15 Minuten lang mit 1 M KOH im Ultraschallgerät gereinigt, mit Milli-Q-Wasser gespült und mindestens 30 Minuten lang unter UV-Licht sterilisiert . Frisch isolierte Gehirnkapillaren wurden 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur auf die oben genannten Schalen plattiert und mit 500 µl 1x PBS gewaschen. Die Kapillaren wurden mit 200 µl 3 % PFA + 0,1 % Glutaraldehyd 10 Minuten lang bei Umgebungstemperatur fixiert und mit 200 µl 0,1 % NaBH4 7 Minuten lang bei Umgebungstemperatur reduziert. Die Kapillaren wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 200 µl Blockierungspuffer (3 % BSA + 0,2 % Triton X-100 in PBS) 120 Minuten lang bei Umgebungstemperatur auf dem Kipphebel blockiert. Dann wurden 200 µl Primärantikörper-Cocktail für 60 Minuten bei Umgebungstemperatur auf den Kipphebel gegeben und fünfmal mit 200 µl Waschpuffer (0,2 % BSA + 0,05 % Triton X-100 in PBS) für 15 Minuten pro Waschgang bei Umgebungstemperatur gewaschen auf der Wippe. Nach dem Waschen wurden 150 µl Sekundärantikörper-Cocktail 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur zugegeben und dreimal mit 200 µl Waschpuffer jeweils 10 Minuten lang auf dem Wippschüttler gewaschen. Die Kapillaren wurden mit 200 µl 3 % PFA + 0,1 % Glutaraldehyd für 10 Minuten bei Umgebungstemperatur nachfixiert und in 500 µl PBS gelagert und in STORM-Bildgebungspuffer [7 µl GLOX (Sauerstofffänger) und 70 µl MEA (Cysteaminhydrochlorid)] aufbewahrt. + 620 µl Puffer B (Tris-HCL/NaCl)] während der Bildgebung mit einem Nikon N-SIM N-STORM (Nikon) Mikroskop.

Mit Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Schnitte (10 μm) aus dem Gehirn wurden rehydriert und 3 Minuten lang bei Umgebungstemperatur mit 95 %iger Ameisensäure vorbehandelt, um Antigene freizulegen. Nach dem Spülen in 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer mit 150 mmol/L NaCl (pH 7,4) wurden die Gehirnschnitte mit Primärantikörpern gegen menschliches Amylin (Anti-menschliches Amylin; T-4157; Peninsula Laboratories) und Maus-Antikörper inkubiert -Aβ-Antikörper 6E10 (803002, Biolegend) über Nacht bei 4 °C. Duolink in situ PLA (Duolink In situ PLA, DUO92004, Sigma, USA) wurde gemäß dem veröffentlichten Protokoll26 durchgeführt. Kurz gesagt, zum Nachweis primärer Antikörperpaare wurden die Schnitte 90 Minuten lang mit Oligonukleotid-konjugiertem Anti-Maus-IgG MINUS und Anti-Kaninchen-IgG PLUS (PLA-Sonden), verdünnt 1:6 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, bei 37 °C inkubiert. Amplifizierte DNA-Stränge wurden mit an ein Fluorophor konjugierten Oligonukleotiden nachgewiesen und die Kerne mit Hoechst-Farbstoff gefärbt.

Jede Blutprobe (100 µl) wurde mit einer Mischung aus CD14- (Abcam, ab203294, 1:400) und humanen Amylin-Primärantikörpern (Santa Cruz, SC-377530, 1:100) 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das Blut wurde in 2 ml Lysepuffer (1 × BD-Lyselösung, Kat.-Nr. 349202, BD Biosciences) 5 Minuten lang lysiert und in 1 × PBS mit 4 % fötalem Kälberserum (FCS) gewaschen. Die nach dem Waschen verbleibenden Zellen wurden 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur in sekundären Antikörpern inkubiert, dann gewaschen und in 0,5 ml 1 × PBS mit 4 % FCS resuspendiert. Sekundärantikörper waren Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) (Kat.-Nr. A11029; Invitrogen, Verdünnung 1:200 in 1×PBS mit 4 % FBS) für menschliches Amylin und Alexa Fluor 568 Ziegen-Anti-Maus (Kat.-Nr. A11004). , Invitrogen, Verdünnung 1:200, in 1xPBS mit 4 % FBS), jeweils für CD14. Die Durchflussanalyse wurde mit dem Zytometer BD Symphony A3 durchgeführt. Die verbleibenden Zellen wurden auf SSC-A vs. FSC-A untersucht, um die Populationen lebender Zellen zu bestimmen. Dubletts (aggregierte Zellen) wurden mit FSC-H vs. FSC-A herausgefiltert. Nicht aggregierte Zellen wurden weiter untersucht, um Monozyten auszuwählen, die positiv für CD14 und/oder menschliches Amylin waren. Zur Festlegung der oberen und unteren Grenzen wurden eine Negativkontrolle (kein Antikörper) und eine Positivkontrolle (menschliche Monozyten) verwendet (ergänzende Abbildung S4).

Die Daten wurden mit BDFacsDiva erfasst und mit der Software FlowJo v10 analysiert.

Gefrorenes menschliches Gehirngewebe wurde in Homogenatpuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaF, 2 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 1 % (v/v) Protease- und Phosphataseinhibitoren, pH 7,5) homogenisiert. . Homogenate wurden 30 Minuten lang bei 4 ° C und 17.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde nach Zentrifugation vom Pellet getrennt und dann für alle Experimente verwendet. Gefrorene Rattenhirnproben wurden mit 1 % Triton-Puffer (25-faches Gewebevolumen) homogenisiert, der 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100 (v/v), 1 % (v/v) Protease- und Phosphataseinhibitoren, pH 7,5. Die Homogenisate wurden 15 Minuten lang auf Eis belassen. Die Homogenate wurden 15 Minuten lang bei 4 ° C und 22.000 × g zentrifugiert. Der Überstand (Triton-lösliche Fraktion) wurde vom Pellet abgetrennt und für alle Experimente verwendet.

Amylin ELISA (EZHA-52K, Millipore Sigma) wurde zur Messung der Amylinkonzentrationen in Vollblutlysaten, Plasma, Kapillarlysaten und Gehirnhomogenaten verwendet. Die Insulinkonzentration wurde in Vollblutlysaten mit einem Sandwich-ELISA-Kit (AYQ-E10465, Testlösung) gemessen. Aβ42-Konzentrationen in Gehirnhomogenaten wurden mit dem Sandwich-ELISA-Kit für Aβ42 (Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. KHB3441) gemessen. ELISAs für IL-1β (ab255730, abcam), Arginase 1 (MBS289817, MyBioSource) und Arginase 2 (MBS7216305, MyBioSource) wurden gemäß den Protokollen des Herstellers verwendet. Die Konzentrationen der Zielproteine ​​wurden auf die Menge des gesamten Proteineintrags normalisiert, der mithilfe der BCA-Methode ermittelt wurde.

Die Arginaseaktivität wurde in Mikrogefäßlysaten des Gehirns mithilfe eines kolorimetrischen Tests (MAK112, Sigma, MO, USA) gemessen. Der Assay wurde gemäß dem veröffentlichten Protokoll34 durchgeführt. Kurz gesagt, die Proben wurden mit 10 µl 5× Substratpuffer 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Den leeren Probenvertiefungen wurde kein Substrat hinzugefügt. Um die Arginase-Reaktion zu stoppen, wurden 200 µl des Harnstoffreagenzes in jede Vertiefung gegeben (Harnstoffstandard, Wasser, Proben und Probenleerwert). Anschließend wurden 10 µl 5x-Substratpuffer in die leeren Probenvertiefungen gegeben und 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Absorptionsmessung erfolgte bei 430 nm. Die Arginase-Aktivität wurde anhand der Analyseanweisungen des Herstellers berechnet.

Der Nitrit-Assay (M36051, Molecular Probes) und der Nitrat-Assay (ab65328, Abcam) von Rattenplasmaproben wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, für den Nitrit-Assay wurden die ersten 100 µl des Arbeitsreagenzes zur Nitrit-Quantifizierung auf eine Mikroplatte geladen, und dann wurden 10 µl Nitrit-Standard und Plasmaproben in Duplikaten hinzugefügt. Die Mikroplatte wurde 10 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert und dann wurden 5 µl Nitrit-Quantifizierungsentwickler in jede Vertiefung gegeben. Nach optimaler Farbentwicklung wurden Fluoreszenzintensitäten bei 365/450 nm (Anregung/Emission) gemessen. Für den Nitrat-Assay wurden die ersten 85 µl Nitratstandards und 85 µl Plasmaproben in Duplikaten auf die Mikrotiterplatte geladen, dann wurden 5 µl Nitratreduktase und 5 µl Enzym-Cofaktor zu jedem Standard und jeder Probenvertiefung hinzugefügt. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Anschließend wurden zu jedem Standard und jeder Probenvertiefung 5 µl Verstärker hinzugefügt, gefolgt von 50 µl Griess-Reagenz R1 und R2. Die Ausgabeintensitäten wurden auf einem Mikroplatten-Lesegerät bei 540 nm gemessen.

Gehirnkapillaren wurden mithilfe des veröffentlichten Protokolls18 aus Rattengehirnen isoliert. Die Gehirne wurden in eiskaltem PBS homogenisiert und durch vorsichtiges Umdrehen der Röhrchen mit 30 % Ficoll-Lösung gemischt und dann 20 Minuten bei 4 ° C und 5800 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in eiskaltem PBS mit 1 % BSA resuspendiert und durch die Glasperlensäule geleitet. Die Perlen wurden in PBS mit 1 % PBS unter Verwendung einer 25-ml-Pipette gerührt und die Lösungen wurden zu gleichen Teilen in zwei 50-ml-Röhrchen aufgeteilt. Die Röhrchen wurden zentrifugiert und die Pellets wurden in 0,5 bis 1 ml PBS gelöst und für Experimente verwendet.

Die mittleren Gehirnarterien wurden entfernt, von Bindegewebe gereinigt und in Verdauungspuffer gelegt, der (in mmol/l) 130 NaCl, 1 KCl, 0,2 CaCl2, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 3 Pyruvat, 25 HEPES und 22 Glucose (an den pH-Wert angepasst) enthielt 7.4 mit NaOH). Die Arterien wurden dann 15 Minuten lang bei 37 °C in Verdauungspuffer, ergänzt mit Papain (0,5 mg/ml) und Dithiothreitol (1 mg/ml), inkubiert, gefolgt von einer zweiten Inkubation (15 Minuten bei 37 °C) in Verdauungspuffer, ergänzt mit Sigma Kollagenasen Typ F und Typ H (jeweils 1 mg/ml). Anschließend wurden die Arterien mit Verdauungspuffer gewaschen und 15 Minuten lang auf Eis gehalten. Anschließend wurde vorsichtig mit einer feuerpolierten Pasteurpipette geschüttelt, um eine Zellsuspension herzustellen.

Der Arterientonus wurde in frisch isolierten Pial- und hinteren Hirnarterien unter Verwendung eines IonOptix-Gefäßdurchmessersystems und eines veröffentlichten Protokolls gemessen36. Kurz gesagt wurden Arterien aus einem frischen Rattenhirn isoliert und frei von Bindegewebe präpariert. Zweige wurden in HEPES-PSS (141,9 mM NaCl, 4,7 mM KCL, 1,7 mM MgSO4, 0,5 mM EDTA, 2,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 1,2 mM KH2PO4 und 5 mM Glucose) abgebunden. Ein Ende der Arterie wurde über eine Mikropipette in der Versuchskammer des Myographen kanüliert und das andere Ende wurde blind verschlossen. Das Fehlen von Leckagen wurde durch die Aufrechterhaltung eines stabilen Drucks überprüft. Zunächst wurde der intraluminale Druck 15 Minuten lang bei 10 mmHg gehalten, dann wurde der intraluminale Druck von 20 auf 60 mmHg erhöht (20 mmHg → 40 mmHg → 60 mmHg → 80 mmHg → 100 mmHg → 120 mmHg), wodurch die Entwicklung des arteriellen Tonus stimuliert wurde. Der stabile Durchmesser nach jedem Anstieg des intravaskulären Drucks wurde als aktiver Durchmesser aufgezeichnet. Als nächstes wurde HEPES-PSS durch 0 Calcium und 2 mM EGTA ersetzt, um den arteriellen passiven Durchmesser zu bestimmen. Der intraluminale Druck wurde in die entgegengesetzte Richtung reduziert und der maximale passive Durchmesser wurde für jeden Druckpunkt aufgezeichnet. Der Arterientonus wurde anhand der folgenden Formel berechnet: Arterientonus = ((Passiver Durchmesser – aktiver Durchmesser)/passiver Durchmesser) *100).

Zur Immunpräzipitation von Aβ aus Gehirnhomogenaten und Plasma wurde ein veröffentlichtes Protokoll verwendet21. Kurz gesagt, 1 mg Protein wurde mit Anti-Ratten-Aβ (2 µg; CST2454; Cell Signaling Technology) über Nacht mit End-over-End-Rotation bei 4 °C inkubiert. Der Antigen-Antikörper-Komplex wurde 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur zur Harzaufschlämmung von immobilisiertem Protein A/G gegeben, gewaschen und die Proben wurden unter Verwendung von Elutionspuffer aus den Harzen eluiert. Das Eluat wurde für die Western-Blot-Analyse verwendet. Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked Whole Ab (vom Esel) (Cytive, Kat.-Nr. NA934V-HRP), gegen IgG der leichten und schweren Kette, war der sekundäre Antikörper (Verdünnung 1:20.000).

Die Western-Blot-Analyse wurde an isolierten Hirnkapillaren, Hirngewebehomogenisat und Plasma von Ratten unter Verwendung veröffentlichter Protokolle15,18,21,25,26,34 durchgeführt. RIPA-Puffer mit 2 % SDS wurde verwendet, um Aβ-Monomere aus gefrorenen Gehirnproben zu gewinnen. Das Lysat wurde 30 Minuten lang bei 17.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde nach Zentrifugation vom Pellet abgetrennt und dann für das Western Blot verwendet. Der Gesamtproteingehalt wurde mithilfe eines BCA-Kits (23225, ThermoFisher) geschätzt. Anti-LRP1-Antikörper, der die β-Untereinheit von LRP1 erkennt (1:1.000; Klon 5A6; sc-57351; Santa Cruz), Anti-P-Glykoprotein oder Pgp (1:1000, ab170904, Abcam), polyklonales Kaninchen-Anti-Amylin ( 1:2000; T-4157, Bachem-Peninsula Laboratories, CA), Anti-Ratten- und Human-Aβ (1:1.000; 2454; Cell Signaling Technology), Maus-Anti-β-Actin (1:10.000; Klon BA3R; MA5-15739). ; Thermo-Fisher), monoklonales Maus-Anti-GAPDH (1:10.000; Klon 6C5; ab8245; Abcam), konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG-HRP (1:30.000; NA934VS; GE Healthcare) und konjugiertes Anti-Maus-IgG-HRP (1: 20.000; NXA931; GE Healthcare) waren Primärantikörper. Immunpräzipitiertes Ratten-Aβ aus Gehirnhomogenaten und passendes Plasma (50 µg Protein aus Gewebehomogenat oder immunpräzipitierte Ratten-Aβ-Elution) wurden auf 8 % SDS-PAGE-Gele geladen. Aggregiertes Aβ aus Gehirnhomogenaten wurde in nativer PAGE (nicht reduzierend; nicht denaturiert) aufgelöst. Monomere Aβ-Peptide wurden in sauren Bis-Tris-Gelen mit 8 M Harnstoff aufgelöst. Um das Signal für monomeres Aβ zu verstärken, wurden die Membranen vor dem Blockierungsschritt 3 Minuten lang in PBS gekocht. LRP1 in Zell- und Gehirnkapillarlysaten wurde unter Verwendung von 4–12 % Bis-Tris-Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen aufgelöst. HRP-konjugierte Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Antikörper waren Sekundärantikörper. Die gleiche Beladung in Western-Blot-Experimenten wurde durch erneute Untersuchung mit einem monoklonalen Anti-β-Actin-Antikörper (gezüchtet in Mäusen, Klon BA3R, Thermo Scientific; 1:2000) verifiziert. Die Proteingehalte wurden durch densitometrische Analyse mit der ImageJ-Software verglichen. Es wurden Negativkontrollexperimente durchgeführt, um die Spezifität der im Western Blot nach Immunpräzipitation identifizierten Banden zu testen (Abb. 5b). Kurz gesagt, doppelte Gehirnhomogenat- und Plasmaproben (1 mg Gesamtprotein) wurden für die Immunpräzipitation verwendet mit: 1, Anti-Aβ-Antikörper (CST2454; Cell Signaling Technology); und 2, Anti-IgG-Antikörper (Cytive, Kat.-Nr. NA934V-HRP). Nach dem Blotten und Blockieren wurden beide Membranen mit dem Anti-Aβ-Antikörper inkubiert und gemeinsam weiter analysiert und abgebildet. Die Ergebnisse zeigen keine oder nur geringe Signalintensitäten der Immunreaktivität im IgG-immunpräzipitierten Probensatz (ergänzende Abbildung S5), was die Spezifität des Aβ-Antikörpers zeigt.

Lyophilisiertes amidiertes menschliches Amylinpeptid (Anaspec #AS-60254-1) wurde in PBS pH 7,4 auf eine Konzentration von 50 µM gelöst. Die Mischung wurde 72 Stunden lang bei 37 °C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert, damit Amylin Aggregate bilden konnte. Aggregierte humane Amylinlösung wurde 9–10 Monate alten AKO-Ratten eine Woche lang täglich über die Schwanzvene injiziert (60 µg/kg) (n = 3 männliche Ratten).

Wir verwendeten ein In-vitro-BBB-Modell mit Amylinablagerung auf der EC-Monoschicht und daraus resultierenden Auswirkungen auf den Aβ-Transport durch die EC-Monoschicht. Kurz gesagt, primäre mikrovaskuläre Endothelzellen des Rattenhirns (Cell Applications Inc) wurden auf Transwell-Clear-Einsätze mit 24 Vertiefungen und einer Polycarbonatmembran mit 0,4 μm Poren (Costar, Corning, NY, USA) ausplattiert und primäre Astrozyten des Rattenhirns (Sigma) wurden dort kultiviert Bodenbrunnen. Die Barriereintegrität wurde anhand des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) unter Verwendung des EVOM2-Messgeräts mit STX-3-Elektroden (World Precision Instruments) gemessen. Der maximale TEER wurde innerhalb von 8–10 Tagen in Kultur erreicht. Die BHS-Permeabilitäten für menschliches Amylin (10 μM; Anaspec; AS-60254-1), Ratten-Amylin (10 μM; American Peptide) und DMSO (1 mM; Vehikel) wurden unter Verwendung von FITC-Dextran 4 kDa (Fisher Scientific), verdünnt in Hank's, bewertet Balanced Salt Solution (HBSS)-Puffer mit 0,1 % BSA (HBSS-BSA) als parazellulärer Diffusionsmarker. Permeabilitätskoeffizienten wurden anhand der Formel berechnet; P = (ΔQ/Δt)/(A*C0), (ΔQ/Δt) = Rate der FITC-Dextran-Änderung; A = Oberfläche des Einsatzes (0,33 cm2); C0 = Erster FITC-Dextran-Eingang.

In den Aβ42-Transzytoseexperimenten wurde die EC-Monoschicht 24 Stunden lang mit menschlichem Amylin (10 μM) oder Vehikel (DMSO) inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Lumenkammer durch HBSS-BSA und die Abluminalkammer durch Aβ(1–42)-FAM (5 µM; Bachem) bzw. FITC-Dextran ersetzt. Aβ(1–42)-Proben wurden aus der Lumenkammer entnommen, um die Aβ(1–42)-FAM- und FITC-Dextran-Fluoreszenzintensitäten sowie den Aβ(1–42)-Transzytosequotienten (TQ) zu messen, wie zuvor beschrieben [38] : TQ = (Aβ(1–42) − FAM-Luminal /Aβ(1–42) − FAM-Eingabe)/(FITC-Dextran-Luminal − FITC-Dextran-Eingabe).

Der CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega) wurde verwendet, um die Zytotoxizität von amyloidbildendem menschlichem Amylin auf der EC-Monoschicht zu bewerten.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNAqueous Total RNA Isolation Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Invitrogen, AM1914) isoliert. Die cDNA-Synthese und -Amplifikation erfolgte mit dem iTaq Universal SYBR Green One-Step Kit (Biorad; 1725151) mit den folgenden Primersequenzen: LRP1: vorwärts (Fwd) 5ˊ-TTGTGCTGAGCCAAGACATC-3ˊ, rückwärts (Rev) 5ˊ-GGCGTGGAAGACATGTAGGT-3ˊ; und GAPDH: Fwd 5ˊ-GCTGCGTTTTACACCCTTTC-3ˊ, Rev 5ˊ-GTTTGCTCCAACCAACTGC-3ˊ (IDT, Inc, USA). Zur miRNA-Quantifizierung wurde cDNA aus Gesamt-RNA unter Verwendung eines miRNA-cDNA-Synthesekits mit Poly(A)-Polymerase (ABMgood, G902) synthetisiert. cDNA wurde unter Verwendung von SYBR Green Mastermix (Biorad) zusammen mit miRNA-spezifischen Primern von (rno-miR-103-3p, MPR00332; rno-miR-107-3p, MPR00335; RNU6 house Keeping gene, MP-r99998) (ABMgood) amplifiziert. Die Daten wurden mit der 2−ΔΔCt-Methode analysiert und die Experimente auf GAPDH oder U6 miRNA normalisiert.

Um die Rolle der miRNA-Signalisierung bei der Amylin-induzierten Unterdrückung der endothelialen LRP1-Expression zu untersuchen, verwendeten wir die Transfektion von mikrovaskulären ECs des Rattenhirns mit miR-103–3p (MCR01039), miR-107-3p (MCR01045) und Kontrollmimetika (MCH00000) ( ABMgut). Antagomir miR-103-3p (IH-320345-05-0005), miR-107-3p (IH-320348-05-0005) und die Negativkontrolle (IN-001005-01-05) (Dharmacon Inc.) wurden verwendet ein Versuch, den LRP1-Ausdruck zu retten. Alle Transfektionen wurden mit RNAiMAX (Invitrogen) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll durchgeführt. Kurz gesagt, ECs wurden bei 50 % Konfluenz in Platten mit sechs Vertiefungen ausplattiert, gefolgt von einer Cotransfektion mit entweder 100 nM 103-3p- und 107-3p-Mimetika oder Antagomiren zusammen mit ihren jeweiligen Negativkontrollen. Nach 12 Stunden wurden mit Antagomir behandelte Zellgruppen 24 Stunden lang weiter mit 10 μM menschlichem Amylin behandelt. Nach 36 Stunden Transfektion wurden die Zellen für die Western-Blot-Analyse geerntet.

Lyophilisiertes menschliches Amylin (oben) wurde in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) auf 100 µM rekonstituiert. Mit Tris-HCl wurden unterschiedliche Konzentrationen hergestellt. Zu jedem Zeitpunkt wurden jeweils 50 µL in eine 96-Well-Platte mit 50 µL 0,016 mg/ml (50,17 mM) Thioflavin T (Sigma) gegeben. Rote Blutkörperchen (RBCs) wurden 1:10 mit PBS verdünnt. In jede Vertiefung wurden 50 µL verdünntes Erythrozyten/Kapillarröhrchen gegeben. Dann wurden 50 µL einer 0,016 mg/ml ThioT-Lösung (hergestellt in PBS) in jede Vertiefung gegeben. Die Fluoreszenz bei 437 nm Anregung und 485 nm Emission wurde gemessen. Die für die Signalintensitätserkennung optimierte Endkonzentration von ThioT betrug 50 µM. Die Ergebnisse wurden auf den gesamten Proteineintrag normalisiert (RFU/µg – Relative Fluoreszenzeinheit/µg). Die Daten werden als fache Änderungen im Vergleich zu WT-Ratten (oder APP/PS1-Ratten) angezeigt, da es sich bei dem Experiment nicht um einen quantitativen Test handelt (keine Peptidstandards).

Die Lipidperoxidation wurde in isolierten glatten Muskelzellen und kultivierten mikrovaskulären ECs des Rattenhirns unter Verwendung des veröffentlichten Protokolls51 gemessen. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit der Fluoreszenzsonde 4,4-Difluor-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-undecansäure (C11) inkubiert -BODIPY581/591; D3861; Invitrogen; OR) und Liperfluo für 20 Minuten bei Umgebungstemperatur. Nach der Färbung wurden die Zellen viermal gewaschen und mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert.

Die unterschiedliche Expression auf Genebene zwischen HIP- und WT-Ratten (n = 10 Männchen/Gruppe) wurde analysiert, um zu testen, ob Gehirngene direkt auf eine Amylin-vermittelte zerebrovaskuläre Entzündung nach der Entwicklung zerebrovaskulärer Amylinablagerungen reagieren. Die RNA der Großhirnrinde wurde mit dem RNeasy Mini Kit von Qiagen (Ref.-Nr. 74104) isoliert. Omega Bioservices führte die Vorbereitung und Sequenzierung der RNAseq-Bibliothek mit dem Illumina HiSeq 2500 durch. Die RNAseq-Daten wurden mit der PartekFlow-Software (Partek, MO) analysiert. Kurz gesagt, RNAseq-Fastq-Dateien wurden importiert, mit dem Referenzgenom der Ratte (Rattus norvegicus-rn7) abgeglichen und auf Genebene mithilfe der Ensembl105-Annotation quantifiziert. Die RNAseq-Lesezahlen wurden normalisiert und mithilfe des DESeq2-Algorithmus weiter auf die unterschiedliche Genexpression zwischen HIP- und WT-Gruppen analysiert. Die Häufigkeit der RNA-Transkripte von 403 Genen hatte P-Werte ≤ 0,05 zwischen der HIP- und der WT-Gruppe. Diese differentiell exprimierten (DE) Gene wurden mit der Ingenuity Pathway Analyses-Software (IPA, Qiagen) auf eine Anreicherung kanonischer Signalwege und mit DAVID (NIH) auf eine Anreicherung biologischer Prozesse dieser DE-Gene in der Genontologie (GO) abgefragt.

Die Anzahl der Proben oder Tiere in jeder Analyse, die durchgeführte statistische Analyse und die P-Werte werden in Abbildungen und Abbildungslegenden angegeben. Die Probengröße für die Tierverhaltensstudie wurde auf der Grundlage einer Pilotstudie bestimmt. Die Stichprobengröße wurde mithilfe von Excel mit bekannter Standardabweichung, einem vertraulichen Intervall von 95 % und einem Alpha von 0,05 berechnet. Der D'Agostino-Pearson- und Kolmogorov-Smirnov-Test wurde verwendet, um die Normalverteilung kontinuierlicher Variablen zu testen. Parametrische Vergleiche kontinuierlicher Variablen mit Normalverteilungen wurden mithilfe eines zweiseitigen ungepaarten t-Tests durchgeführt. Bei Bedarf wurde die Welch-Korrektur mit dem t-Test verwendet, um ungleiche Varianz aus ungleichen Stichprobengrößen zu berücksichtigen. Parametrische Vergleiche von drei Gruppen oder mehr Gruppenmittelwerten wurden unter Verwendung einer einfaktoriellen oder zweifaktoriellen ANOVA mit dem Bonferroni-Posttest durchgeführt. Die Kruskal-Wallis-Einweg-Varianzanalyse wurde für Analysen kontinuierlicher Variablen mit verzerrten Verteilungen und ähnlicher Verteilung über die Gruppen hinweg verwendet (wie in der ergänzenden Abbildung S1a). Beziehungen zwischen zwei kontinuierlichen Variablen wurden durch Korrelationsanalyse analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM oder als Box- und Whisker-Plots dargestellt. Der Unterschied zwischen den Gruppen wurde als signifikant angesehen, wenn P < 0,05. Alle Analysen wurden mit GraphPad Prism 8.1 durchgeführt.

Die Replikation wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Daten zu überprüfen. ELISAs und Western Blots wurden in Duplikaten von zwei verschiedenen Teammitgliedern durchgeführt. Die Daten waren bei der Replikation reproduzierbar. An allen menschlichen Gewebeproben wurden Beobachter-Blindanalysen durchgeführt; Die Ergebnisse wurden dem AD Center der University of Kentucky übermittelt, um die Zusammenhänge mit der AD-Pathologie/kognitiven Funktion zu bewerten. Um Verzerrungen vorzubeugen, wurden die Forscher auch bei der Bewertung der histologischen Analysen und bei den Längsschnitttests zum Verhalten der Tiere verblindet. Die Forscher waren während der pharmakologischen Intervention (z. B. amiR-Behandlungen von EC-Zellen) oder der Injektion (menschliches Amylin in AKO-Ratten) nicht verblindet, da die Interventionen von demselben Personal durchgeführt wurden. Bei den meisten biochemischen Tests wurden die Forscher nicht geblendet, da dies nicht notwendig ist. Die Datenerfassung wurde gleichzeitig für Versuchsgruppen mit derselben Einstellung durchgeführt.

Alle in diesem Manuskript verwendeten Antikörper sind von Herstellern und anderen Veröffentlichungen gut etabliert. Wir haben in dieser Studie eine Validierung für Amylin-Antikörper durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Die den Diagrammen zugrunde liegenden Quelldaten sind als „Supplementary Data Figure“-Dateien verfügbar. Unbeschnittene und unbearbeitete Bot-Bilder sind als ergänzende Abbildung 6 verfügbar. Die Quelldaten für alle Abbildungen werden in einer einzigen Excel-Datei als „Ergänzende Daten 1“ bereitgestellt. Die in dieser Veröffentlichung besprochenen RNAseq-Daten wurden im Gene Expression Omnibus des NCBI hinterlegt und sind über die GEO-Serien-Zugangsnummer GSE221450 zugänglich.

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Teilweise finanziert durch: University of Kentucky Research Alliance to Reduce Diabetes-Associated Microvascular Dysfunction (ADAM) und National Institutes of Health R01 NS116058, R01 AG057290, R01 AG053999, R01 HL 149127 und P30 AG028383 sowie Alzheimer's Association VMF-15-363458. UK Dementia Research Institute, das seine Mittel von DRI Ltd erhält, finanziert von: dem UK Medical Research Council, der Alzheimer's Society und Alzheimer's Research UK; Medical Research Council (Auszeichnungsnummer MR/N026004/1); Wellcome Trust Hardy (Auszeichnungsnummer 202903/Z/16/Z); Dolby Family Fund; National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedizinisches Forschungszentrum; BRCNIHR Biomedical Research Centre am University College London Hospitals NHS Foundation Trust und am University College London. HL wurde durch ein Stipendium der American Heart Association (18PRE33990154) unterstützt. TL wird durch ein Alzheimer's Research UK Senior Fellowship unterstützt. HZ ist ein Wallenberg-Stipendiat, der durch Zuschüsse des Schwedischen Forschungsrats (#2018-02532), des Europäischen Forschungsrats (#681712 und #101053962), der schwedischen staatlichen Unterstützung für klinische Forschung (#ALFGBG-71320) und der Alzheimer Drug Discovery Foundation unterstützt wird (ADDF), USA (#201809-2016862), der AD Strategic Fund und die Alzheimer's Association (#ADSF-21-831376-C, #ADSF-21-831381-C und #ADSF-21-831377-C), die Olav Thon Foundation, die Erling-Persson Family Foundation, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Hjärnfonden, Schweden (#FO2019-0228), das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 860197 (MIRIADE), die Gemeinsames Programm der Europäischen Union – Neurodegenerative Krankheitsforschung (JPND2021-00694) und das UK Dementia Research Institute an der UCL (UKDRI-1003).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nirmal Verma, Gopal Viswanathan Velmurugan.

Abteilung für Pharmakologie und Ernährungswissenschaften, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Nirmal Verma, Gopal Viswanathan Velmurugan, Edric Winford, Han Coburn, Deepak Kotiya, Noah Leibold, Laura Radulescu, Sanda Despa, Kuey C. Chen und Florin Despa

Das Forschungszentrum für gesunden Stoffwechsel, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Nirmal Verma, Deepak Kotiya, Noah Leibold, Laura Radulescu, Sanda Despa und Florin Despa

Abteilung für Neurowissenschaften, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Edric Winford und Florin Despa

UKHC Genomics Laboratory, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Kuey C. Chen

Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Linda J. Van Eldik, Peter T. Nelson, Donna M. Wilcock und Gregory A. Jicha

Institut für Physiologie, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Donna M. Wilcock

Abteilung für Neurologie, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

Gregory A. Jicha, Ann M. Stowe, Larry B. Goldstein und Florin Despa

Zentrum für Magnetresonanztomographie und Spektroskopie, University of Kentucky, Lexington, KY, USA

David K. Powell

NMR-Einrichtung, University of California, Davis, CA, USA

Jeffrey H. Walton

Abteilung für Pharmakologie, University of California, Davis, CA, USA

Manuel F. Shuttle

Medizinische Fakultät, University of Louisville, Louisville, KY, USA

Matthew A. Nystoriak

Abteilung für Physiologie, Entwicklung und Neurowissenschaften, Universität Cambridge, Cambridge, CB2 3EG, Großbritannien

Andrew J. Murray

Abteilung für Neurologie, Universitätsklinikum Utrecht, Utrecht, Niederlande

Geert-Jan Biessels

Abteilung für Grundlagen- und klinische Neurowissenschaften, King's College London, London, Großbritannien

Claire Troakes

Abteilung für Psychiatrie und Neurochemie, Institut für Neurowissenschaften und Physiologie, Sahlgrenska-Akademie an der Universität Göteborg, Mölndal, Schweden

Henrik Zetterberg

Labor für klinische Neurochemie, Universitätskrankenhaus Sahlgrenska, Mölndal, Schweden

Henrik Zetterberg

Abteilung für neurodegenerative Erkrankungen, UCL Queen Square Institute of Neurology, Queen Square, London, WC1N 3BG, Großbritannien

Henrik Zetterberg, John Hardy und Tammaryn Lashley

UK Dementia Research Institute am UCL und Abteilung für Neurodegenerative Erkrankungen, UCL Institute of Neurology, University College London, London, Großbritannien

Henrik Zetterberg & John Hardy

Reta Lila Weston Institute, UCL Queen Square Institute of Neurology, 1 Wakefield Street, London, WC1N 1PJ, Großbritannien

John Hardy

UCL Movement Disorders Centre, University College London, London, Großbritannien

John Hardy

Institute for Advanced Study, Hong Kong University of Science and Technology, Sonderverwaltungszone Hongkong, China

John Hardy

Queen Square Brain Bank für neurologische Störungen, Abteilung für klinische und Bewegungsneurowissenschaften, UCL Queen Square Institute of Neurology, London, Großbritannien

Tammaryn Lashley

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NV – Immunhistochemie, Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie, STORM, Hirnkapillar- und Arterienisolierung; GVV – LRP1-Western-Blot-Analyse und In-vitro-BBB-Experimente; EW – Durchflusszytometrie und Hirngewebeverarbeitung für RNAseq-Analysen; DK, NL und LR – Ratten-Genotypisierung, Gewebesammlung und -verarbeitung, ELISA; HC – Rattenverhalten, Th-T-Assay im Rattenblut; DKP und JHW – MRT- und ASL-Experimente; KCC – RNAseq-Datenanalyse; SD – SMC-Isolierung und konfokale Mikroskopie-Analyse von oxidativem Stress in isolierten SMCs; AMS – Durchflusszytometrie-Training für EW und Durchflusszytometrie-Datenanalyse; LVE – Versuchsprotokoll zur Neuroinflammation; AJM – experimentelles Protokoll zur vaskulären Arginase-NO-Regulation; MFN und MAN – Druckmyographie-Experimente; GAJ, PTN, DMW, LVE, HZ, CT, TL und JH – bereitgestellte menschliche Proben; GAJ, LGB, PTN, JH, HZ, TL, GJB und FD – Interpretation der Amylin-Aβ-Pathologie; FD – Konzeptualisierung, Ressourcen, Datenanalyse und Entwurf des Manuskripts, alle anderen Autoren haben zur endgültigen Form des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Florin Despa.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Chengbiao Wu und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Joao Valente. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Verma, N., Velmurugan, GV, Winford, E. et al. Beeinträchtigung des Aβ-Ausflusses und Entzündung im Zusammenhang mit der zerebrovaskulären Ansammlung von amyloidbildendem Amylin, das aus der Bauchspeicheldrüse ausgeschieden wird. Commun Biol 6, 2 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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Eingegangen: 08. Juli 2022

Angenommen: 21. Dezember 2022

Veröffentlicht: 3. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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